Mecanismes d´especificitat funcional dels complexes CDK-Ciclines Cln

Resumen

La progressió del cicle cel.lular en les cèl.lules eucariotes es deu a l'activació seqüencial de diferents complexos CDK-ciclina. En Saccharomyces cerevisiae una sola CDK, Cdc28, s'associa amb nou ciclines diferents i és la ciclina la que determina la funció del complexe al llarg de cada fase del cicle cel.lular. Les ciclines Cln1 i Cln2 controlen la transició G1 / S. Aquestes ciclines havien estat considerades equivalents per la seva homologia de seqüència, regulació i funció, però una diferència funcional entre elles va ser descrita establint a Cln2 com l'efector principal dels processos morfogenètics durant la transició G1 / S. En aquest treball s´han tractat de descriure les bases moleculars de l´especificitat funcional de Cln2. S'ha realitzat un anàlisi funcional utilitzant ciclines quimèriques que contenen diferents fragments de Cln1 i Cln2 per tal d'identificar les regions responsables de la funcionalitat específica de Cln2 en comparació amb Cln1. Els nostres resultats ens porten a concloure que la regió entre els aminoàcids 225 i 299 del Cln2 és necessària i suficient per a la seva funció específica. També hem estudiat la localització de Cln2 i Cln1. Ambdues ciclines es distribueixen entre el nucli i el citoplasma, però Cln1 mostra una major acumulació nuclear. La via clàssica d´importació participa en l´entrada de les dues ciclines al nucli, però només Cln2 és exportada fora del nucli per la carioferina Msn5. Hem identificat els senyals de localització de les ciclines. El senyal de localització nuclear no es correspon amb cap NLS clàssic descrit i es troba en la regió entre els aminoàcids del 130 al 226 d´ambdues ciclines. Sorprenentment, l´exportació de Cln2 depén de la regió entre els aminoàcids 225 i 299. Aquesta correlació entre la seqüència d´exportació i la regió responsable de la funció específica de Cln2 dóna suport a que siga l'exportació al citoplasma el mecanisme que confereix les seves funcions específiques a Cln2 durant la transició G1/ S. Quan dita regió s´introdueix en Cln1 la ciclina resultant presenta una distribució menys nuclear i és capaç de realitzar les funcions citosòliques pròpies de Cln2. Per tant, sembla ser la seua regulació espacial la que determina la funcionalitat diferencial de Cln1 i Cln2. Paralel.lament s´ha estudiat la degradació de les ciclines i s´ha observat que Cln1 i Cln2 presenten la mateixa estabilitat. Tanmateix, mentre que Cln2 és degradada per SCFGrr1 i SCFCdc4, Cln1 és degradada preferentment per SCFGrr1. La seqüència N-terminal de la ciclina determina el seu patró de degradació: la seqüència de Cln2 és necessària per a que la proteïna siga degradada per SCFCdc4. En conclusió, la degradació no determina la funcionalitat de les ciclines però estableix un nivell més de regulació diferencial entre Cln1 i Cln2 relacionat amb l´anterior, ja que l´estabilitat de les ciclines depén de la localització. Per una altra part s´ha analitzat el paper de Cdc24 en la funció específica de Cln2 concluint que si bé Cln2 sembla més eficient que Cln1 en facilitar l´eixida del nucli de Cdc24, no és aquesta eixida sinò altres funcions en el procés de gemmació les que Cln2 realitza de forma específica. S´han identificat les carioferines responsables del transport de Cdc24: és importada al nucli per la via clàssica d´importació i exportada per Xpo1. S´han identificat tres possibles senyals de localització diferents, un NES i dos NLS, però els anàlisis de mutants en residus d´aquestes regions no han permés demostrar la dependència de la localització de la proteïna Cdc24 d´aquests senyals. Finalment es va realitzar una caracterització dels mutants en les diferents carioferines de la família de la importina ???la cual va mostrar que molts dels mutants podien relacionar-se amb el cicle cel.lular en processos com la regulació d´Start, la replicació o la morfogènesi cel.lular.