Characterizing BCL-2 family protein domains in membranesinsertion, interaction and apoptotic modulation roles

Resum

El objetivo de mi tesis doctoral es el estudio de los dominios transmembrana (TMD) de las proteínas de la familia Bcl-2. La principal función de esta familia de proteínas es la regulación del proceso apoptótico (1,2). Para Ello, se establece un balance de interacciones proteína-proteína entre los miembros pro- y antiapoptóticos de esta familia proteica (3,4). Nuestra hipótesis de trabajo postula que los fragmentos transmembrana de dichas proteínas pueden estar implicados no sólo en su localización subcelular sino también en el establecimiento de la red de interacciones entre proteínas Bcl-2 así como en el desarrollo de su función apoptótica.. Para corroborar esta hipótesis, hemos analizado la capacidad de interacción de los dominios transmembrana, de todos los miembros pro- y antiapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 mediante el sistema ToxR en bacterias, trasladando posteriormente los resultados a un sistema eucariótico por medio de ensayos de complementación de fluorescencia (BiFC). En primer lugar analizamos la capacidad de estos TMDs para homooligomerizar, utilizando tanto el sistema ToxR como BiFC, obteniendo resultados positivos en todos los transmembrana estudiados a excepción de Bid. Los ensayos de complementación de fluorescencia en células tumorales eucariotas permitieron además demostrar la localización mitocondrial de estas interacciones por ensayos de colocalización y fraccionamiento subcelular. El siguiente objetivo fue establecer el patrón de interacciones de cada uno de los TMD con el resto de proteínas de la familia Bcl-2 empleando de nuevo estos sistemas. El análisis de los resultados de ambos estudios nos ha permitido elaborar el primer mapa de interacciones producidas exclusivamente por los dominios transmembrana de las proteínas de la familia Bcl-2 (5). Uno de los puntos clave durante la realización de la tesis doctoral ha sido la búsqueda de aplicaciones clínicas para los TMDs en el campo de los tratamientos antitumorales. Por ello, realizamos la síntesis química de los fragmentos transmembrana de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w y Mcl-1 así como de las efectoras Bax y Bak. Utilizando la interferometría dual polarizada determinamos que los TMDs se asocian e insertan preferentemente en liposomas con una composición de tipo mitocondrial; demostramos además que esta asociación/inserción no afectaba a la membrana mitocondrial interna mediante ensayos de swelling mitocondrial. El siguiente objetivo fue determinar su capacidad para desestabilizar la membrana mitocondrial externa y producir la muerte celular. Específicamente alguno de los péptidos TMD, en mayor grado Bak y Bcl-xL pero también Bcl-2 y Bax, fueron capaces de desestabilizar liposomas con una composición mitocondrial, liberando su contenido de calceína el exterior. El “mitochondrial priming” se basa en sensibilizar a la mitocondria de la célula tumoral para que dicha célula sea más susceptible de responder a distintos tratamientos. Basándonos en esta idea, decidimos utilizar como segunda aproximación concentraciones subletales de éstos péptidos en combinación con el compuesto antitumoral cis-platino (CDDP) para determinar si estos péptidos transmembrana eran capaces de sensibilizar a la mitocondria. Los resultados mostraron que tanto Bcl-xL como Bak (y en un grado más moderado Bcl-2 y Bax) en concentraciones subletales fueron capaces de incrementar la sensibilidad de las líneas tumorales HeLa y HCT-116 frente al estímulo apoptótico de CDDP (6). Los resultados de este estudio abren la posibilidad del uso de estos péptidos transmembrana como herramienta farmacológica capaz de desestabilizar la mitocondria y sensibilizar a las células tumorales frente a estímulos apoptóticos.