Biología celular y molecular de SH3TC2, el gen responsable de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth 4C

Resumen

La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) es una neuropatía hereditaria sensitivo-motora que cursa principalmente con una atrofia y debilidad muscular progresiva distal con pérdida de la sensibilidad en las extremidades. La enfermedad CMT se clasifica en neuropatías desmielinizantes (CMT1) y neuropatías axonales (CMT2). Para ambas entidades se han descrito diversos patrones de herencia. Las formas autosómicas recesivas desmielinizantes (CMT4) y axonales (AR-CMT2) son menos frecuentes aunque suelen presentar un fenotipo clínico más grave y agresivo. En nuestro país se han descrito con relativa frecuencia las formas CMT4A y CMT4C, ésta última en familias de origen gitano [Claramunt R, Sevilla T, Lupo V et al. Clinical Genetics 2007]. Mutaciones en el gen SH3TC2 son responsables de la enfermedad CMT4C. El trabajo realizado en este proyecto de tesis doctoral se puede resumir en dos partes: (1) Estudio de la biología de SH3TC2 y de mutantes clínicos, que han sido recientemente publicados [Lupo V et al. Hum Mol Gen 2009]; (2) Estudio del posible papel de SH3TC2 sobre la ruta de señalización de Nrg1/ErbB. 1. Estudio de la biología de SH3TC2 y de mutantes clínicos. Mediante ensayos de inmunofluorescencia en diferentes líneas celulares, hemos demostrado que SH3TC2 colocaliza con la membrana plasmática y con varios componentes de la ruta endocítica: endosomas tempranos, endosomas tardíos y parcialmente con vesículas recubiertas de clatrina. Además, se ha demostrado que SH3TC2 sufre una miristoilación co-trasducional en la glicina 2 para poderse anclar a las membranas celulares. La localización de SH3TC2 en la membrana plasmática ha sido confirmada también mediante fraccionamiento subcelular en gradiente de sacarosa. Además, ensayos bioquímicos, nos sugieren que la proteína está fuertemente asociada a las membranas celulares y que también se encuentra parcialmente asociada a microdominios ricos en colesterol (balsas lipídicas - en inglés, Lipid Rafts). Posteriormente, estudiamos el efecto sobre la localización de SH3TC2 de mutantes que carecían de los dominios SH3 y/o TPR. Nuestros resultados sugieren que ambos dominios combinados de manera independiente con la miristoilación, son suficientes para permitir que SH3TC2 se una a las membranas celulares. Probablemente, ambos dominios están mediando la interacción de SH3TC2 con otras proteínas. Nuestro objetivo más inmediato fue examinar lo que ocurría con aquellas mutaciones clínicas de SH3TC2 responsables de la enfermedad, y nos preguntamos si estos resultados nos podrían ayudar a deslucidar sobre la patogenicidad de estas mutaciones. Para ello, testamos los efectos de aquellas mutaciones clínicas de SH3TC2 que habían sido encontradas en nuestra serie de pacientes y en nuestro laboratorio, p.R529Q, p.A758D, p.C737_P738delinsX, p.R954X y p.R1109X. También se analizaron otras dos mutaciones ya descritas por su proximidad, junto a p.R529Q y A758D, al primer dominio TPR. Las tres mutaciones que conducen a una proteína truncada y la con cambio de aminoácido p.A758D presentaban el mismo patrón de expresión que la proteína completa de SH3TC2. En cambio, las otras tres mutaciones con cambio de aminoácido (p.R529Q, E657K y R658C), presentaban variaciones en la localización respecto a la proteína completa. La similitud en la localización de estas tres proteínas mutantes sugiere la región que comprende estas tres mutaciones, que incluye el primer dominio TPR, es importante para la localización de SH3TC2. Parece ser que el primer dominio TPR, junto con el dominio de miristoilación, sea suficiente para que la proteína se dirija a su correcta localización. 2. Estudio del posible papel de SH3TC2 sobre la ruta de señalización de Nrg1/ErbB. En un estudio reciente se ha generado y caracterizado el modelo murino deficiente de la proteína Sh3tc2 (KO de Sh3tc2). Este ratón representa un buen modelo para estudiar la fisiopatología de la enfermedad de CMT4C. En este trabajo los ratones KO presentaban un proceso de hipomielinización en edad post-natal de 28 dias (P28). En un proyecto colaborativo con el laboratorio del Dr. Roman Chrast de la Universidad de Lausanne, con el fin de investigar cuál es el estadio primario de establecimiento de la patología en los ratones KO, ahondamos en el estudio de microscopía electrónica examinando ratones con una edad muy temprana (P5 y P10). Nuestros resultados demuestran que las capas de mielina que envuelven los axones, están reducidas en número en el ratón KO, de modo que el proceso de hipomielinización debe de empezar en fase temprana de desarrollo de la mielina. Un estudio comparativo del fenotipo encontrado con otros modelos murino de enfermedades neurodegenerativas, mostró que los ratones KO de ErbB2 presentaban un fenotipo de hipomielinización muy similar al KO de Sh3tc2. ErB2 junto a ErbB3, son receptores fundamentales para los procesos de mielinización, y su actividad está mediada por la Nrg1. La fosforilación cruzada de ErbB2 y ErbB3 conduce a su internalización mediada por proteínas adaptadoras, y la posterior activación de la ruta de señalización I3P/Akt. Nuestro objetivo se centró en estudiar si la deficiencia de Sh3tc2 pudiese afectar la activación normal de la ruta Nrg1/ErbB. Por ello llevamos a cabo análisis de extractos proteicos del endonerium de nervio ciático mediante Western blot. Los resultados demuestraron que los receptores ErbB2 y ErbB3 están hiperfosforilados en los ratones KO de edad temprana (P2 y P5), y que la expresión de Krox20, un factor de transcripción activado también por la ruta Nrg1/ErbB, está fuertemente disminuida a P10. Para determinar como la deficiencia de Sh3tc2 provoca un aumento de la fosforilación de los receptores ErbB2 y ErbB3, se estudió el efecto de la sobreexpresión de Sh3tc2 sobre la internalización del receptor ERB2 en células de HeLa. Los resultados indican que la internalización tanto de ErbB2 aumenta cuando se sobreexpresa SH3TC2. Conjuntamente, estos resultados sugieren que SH3TC2 podría regular la internalización de los receptores ErbB2 y ErbB3, cuya activación es fundamental para los procesos de mielinización de los nervios periféricos. Otros ensayos de inmunofluorescencia confirman nuevamente la asociación entre SH3TC2 y los receptores ErbB durante su internalización. En definitiva, en este trabajo hemos aportado no sólo conocimientos sobre la biología de SH3TC2, sino también sobre los posibles mecanismos patológicos que subyacen en la enfermedad de CMT4C. Además nos proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos relacionados con el desarrollo de la mielina durante la fase de desarrollo.