Efectos del tratamiento con agonistas dopaminérgicos sobre las lesiones endometriósicas

Resumen

La prolactina (PRL) es una hormona hipofisaria que desempeña un papel fundamental en diversas funciones reproductivas, fundamentalmente en la lactancia. En situaciones patológicas que están relacionadas con la presencia de adenomas hipofisarios o ingesta de fármacos psicotropos, los niveles de PRL están elevados y afectan a la función gonadal, pues inhiben la secreción de hormonas hipofisarias como la LH o FSH, ocasionando amenorrea (9%), galactorrea (25%) o ambas (70%) (1).La hiperprolactinemia, por lo tanto, es una causa frecuente de infertilidad por anovulación (2). Por otro lado, la endometriosis es una importante entidad patológica ginecológica estrógeno dependiente cuya prevalencia en mujeres con dolor pélvico crónico y/o esterilidad oscila entre el 20 y 90%, lo que la sitúa en el primer lugar de los problemas ginecológicos benignos (3). La fisiopatología de la esterilidad asociada a endometriosis leve-moderada no es conocida y son muchas las hipótesis que se han postulado para explicarla. Numerosos estudios han demostrado que existe una relación entre hiperprolactinemia e insuficiencia lútea en pacientes infértiles con endometriosis (4,5). Curiosamente, una hiperprolactinemia espontánea, o tras estimulación con distintos agentes, se ha descrito directamente correlacionada con la severidad de la endometriosis (5,6). Sabemos que la PRL es un potente inductor de la angiogénesis y eso se observa fisiológicamente en la decidua durante la implantación y en la mama durante el embarazo (7). Experimentalmente, también en otros tejidos, como el músculo, la PRL induce la angiogénesis (8,9) La PRL tiene su efecto proangiogénico a través de receptores en los vasos (10) y no en el endometrio, como otros han fracasado en demostrar (11). La endometriosis es causada por la existencia de endometrio funcional fuera de la cavidad uterina y se halla fundamentalmente ubicada en el peritoneo, el ovario y en el septo recto-vaginal. Es consecuencia fundamentalmente de la implantación retrógrada de endometrio menstrual (12), puesto que este tiene la capacidad de adherirse e implantar ectópicamente (13) provocando una inflamación en las zonas donde se ubica (14,15). La inflamación y la angiogénesis son dos procesos que están íntimamente asociados a la endometriosis (16). Para que la implantación sea posible, es necesario la adquisición de un aporte vascular y por eso se ha comprobado que si el endometrio de por sí es rico en potencial angiogénico (17), las lesiones endometriósicas son áreas ricas en aporte vascular (18,19). Por todo ello, hoy se supone que la neo-angiogénesis es un pre-requisito para el desarrollo de la endometriosis. Hay una extensa lista de factores que promueven e inhiben la angiogénesis en el endometrio, pero de entre ellos destaca la familia del Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF) (20,21). En la especie humana, se han descrito 5 isoformas conocidas como VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 y VEGF 206, de las cuales las isoformas VEGF 121 y VEGF 165 parecen ser las más implicadas en el proceso de angiogénesis (22). El sistema de ligandos tiene sus receptores específicos presentes en las membranas de las células endoteliales y que pertenecen a la familia de la Tirosin-quinasa (23). Estos receptores son el VEGF-1 (VEGFR-1 o flt-1) y el VEGFR-2 (también Flk-2/KDR) (20,21). Este segundo receptor parece más envuelto que el primero en el proceso de angiogénesis y vasculogénesis (24,25). En los animales de experimentación, Nap et al emplearon diversos agentes antiangiogénicos para inhibir lesiones endometriósicas tras el trasplante de endometrio humano (26), entre ellos un antagonista de la PRL utilizado en tratamientos de hiperprolactinemia, observando una disminución significativa de la indidencia de lesiones endometriósicas y la presencia de vasos respecto a los controles. Existen otros productos se han mostrado efectivos regulando el sistema VEGF. El neurotransmisor dopamina, empleado a niveles no tóxicos, es capaz de provocar la endocitosis del VEGFR-2 en las células endoteliales, previniendo la unión del VEGF a este receptor, un paso crítico en el proceso de neoangiogénesis (27). Como consecuencia, no hay fosforilación del receptor y la subsiguiente cascada de señales. Igualmente, agonistas dopaminérgicos como la bromocriptina (Bro), ampliamente empleado en Ginecología incluso durante la gestación, ejerce la misma acción (27). Pero además, analizando la relación de la PRL con la neoangiogénesis, la posible relación endometriosis- hiperprolactinemia, y la expresión del VEGF en tejido endometrial ectópico, se hace obligado pensar en los antagonistas de la PRL como posible tratamiento de la endometriosis. Nosotros tenemos una línea de investigación abierta en el estudio de otro problema ginecológico denominado síndrome de hiperestimulación ovárica, cuya fisiopatología no está totalmente aclarada. En dos publicaciones (28,29), demostramos que el sistema VEGF, y específicamente la unión de las isoformas VEGF121 y VEGF 165 al VEGFR-2 en el modelo animal, era la responsable del aumento de la permeabilidad capilar y la ascitis observada en estos animales. Empleando microarrays para el análisis de los genes que se expresan en situaciones de SHO, aprendimos que el gen que codifica para la tiroxin-hidroxilasa, un enzima crítico en la síntesis de dopamina, está expresado a la baja (30), por lo que decidimos ensayar los análogos dopaminérgicos en el tratamiento del SHO experimental. Tanto Bro como la Cabergolina fueron capaces de eliminar el SHO (31) fijandose, internalizando y por lo tanto evitando la fosforilación del VEGFR-2, confirmando de esta forma previos estudios en un modelo in vitro (30). Los nuevos agonistas dopaminérgicos, cabergolina y quinagolida, son mejor tolerados que la bromocriptina y son mas empleados en la actualidad en pacientes hiperprolactinémicas. Por ello, pensamos que el empleo de los agonistas dopaminérgicos podría ser también útil en disminuir la angiogénesis en las lesiones endometriósicas en pacientes. Los efectos sobre las lesiones, las vías de administración y dosis, fueron ensayados en un modelo in vivo heterólogo experimental de endometriosis que desarrollamos previamente. Disponemos, por lo tanto, de datos no publicados todavía, que demuestran que estos agentes actúan sobre el VEGFR-2, induciendo una disminución de la expresión del VEGF, junto con la de otros marcadores angiogénicos, en las lesiones peritoneales del modelo animal y como consecuencia hay una inhibición de la neoformación de vasos sanguíneos. HIPÓTESIS Nuestra hipótesis es que tras la administración de agonistas dopaminérgicos (como la quinagolida), empleados para el tratamiento de la hiperprolactinemia, éstos son capaces, mediante su acción sobre el VEGFR-2 y disminución del VEGF, de reducir la angiogénesis en las lesiones endometriósicas humanas, contribuyendo de esta forma a su eliminación. OBJETIVO El objetivo de este proyecto es demostrar la acción antiangiogénica del agonistas dopaminérgico quinagolida, en el endometrio humano y lesiones endometriósicas, para el tratamiento de la endometriosis en pacientes hiperprolactinémicas, mediante el análisis de marcadores bioquímicos y expresión génica de factores implicados en la angiogénesis , pre y post tratamiento con quinagolida. MATERIAL Y MÉTODOS Pacientes y grupos experimentales Los estudios realizados en pacientes humanos y la recogida de muestras se hará de conformidad con las normas sobre experimentación humana dimanantes del código de Nuremberg, declaraciones de Helsinki (1964), Tokio (1975), Venecia (1983), Hongkong (1989), Sydney y complementarias, directiva 91/507/CE, R.D. 561/1993, convenio de Bioética del Consejo de Europa (BOE 20-10-99), y código de Ética y deontología médicas vigente. La viabilidad de estos ensayos clínicos esta basada en los resultados experimentales satisfactorios ya obtenidos. Se realizará un estudio prospectivo que incluirá a una población de 5 pacientes estériles con esterilidad de origen desconocido, dismenorrea, coitalgias o cualquier otro síntoma que haga sospechar la existencia de una endometriosis. También se incluirán mujeres con ecografías que documenten la presencia de endometriomas. Además, estas pacientes deben ser hiperprolactinémicas que, tras un TAC, se descarte la existencia de un adenoma hipofisario que pudiera recomendar la cirugía. Por tanto, todas las pacientes incluidas en el estudio serán mujeres subsidiarias de tratamiento con agonistas dopaminérgicos. Las pacientes seleccionadas serán sometidas a una laparoscopia diagnóstica, para comprobar si poseen focos endometriósicos. También se realizará a cada paciente, en ese momento, un aspirado endometrial y una determinación en sangre de Ca125 y PRL. En el caso de que se encontrasen focos endometriósicos peritoneales, se tomará una biopsia de una lesión endometriósica roja, dejando otra lesión endometriósica roja sin tocar y bien localizada. Serán excluidas aquellas que presenten contraindicación para el uso de agonistas dopaminérgicos o para la cirugía laparoscópica. Cada paciente firmará un consentimiento informado (anexo 1). A continuación, las pacientes comenzarán el tratamiento con el agonista dopaminérgico quinagolida (NORPROLAC) de acuerdo con la posología recomendada para dicho producto en pacientes hiperprolactinémicos. La quinagolida actúa específicamente en el receptor de la dopamina tipo D2 y que a dosis suprafisiológicas tiene poca afinidad por el receptor de la dopamina tipo D1. La especificidad y la naturaleza de la quinagolida (no es un compuesto derivado del cornezuelo de centeno o de la ergolina) reduce el riesgo de efectos secundarios. Los comprimidos de quinagolida se deberán ingerir oralmente con los alimentos una vez al día al acostarse. El régimen de tratamiento de la quinagolida sigue una pauta de titulación. El tratamiento comenzará con un comprimido de 25 µg al día durante los primeros 3 días seguidos de 50 µg al día (2 comprimidos de 25 µg) los siguientes 3 días. A partir del séptimo día la dosis será de 75 µg al día y se mantendrá durante una semana. La dosis diaria será aumentada con 75 µg a intervalos de una semana como mínimo hasta un máximo de 225 µg al día. La dosis final de mantenimiento es de 225 µg al día, pero puede reducirse individualmente en intervalos de 75 µg si la tolerabilidad de la quinagolida no es aceptable. La duración del tratamiento con quinagolida es de 3 meses. Pasado un mes tras el inicio del tratamiento con la quinagolida, las pacientes serán sometidas a una segunda aspiración endometrial durante la fase folicular del ciclo menstrual y a una segunda determinación en sangre de Ca125 y PRL, de forma que podamos comprobar los efectos de la quinagolida durante el tratamiento. Pasados tres meses tras el inicio del tratamiento con la quinagolida las pacientes serán sometidas a una segunda laparoscopia (procedimiento habitual en pacientes estériles operadas por una enfermedad recidivante como la endometriosis) en la que la lesión no tocada y localizada durante la primera laparoscopia será biopsiada, y se realizará una tercera aspiración endometrial durante la fase folicular del ciclo menstrual y determinación en sangre de Ca125 y PRL. Obtención y procesamiento del aspirado endometrial. Para la obtención de endometrio en fase proliferativa, se emplearán cánulas de aspiración endometrial disponibles en el comercio (Pipelle, Prodimed, France). Parte del endometrio será procesado de forma habitual (fijación en parafina y tinción hematoxilina-eosina) para histología, con la intención de descartar patología y confirmar la fase del ciclo menstrual. La mayor parte del aspirado endometrial, se colocará en una placa Petri sobre hielo y será inmediatamente lavado de sangre y moco, con medio de cultivo sin suero (DMEM-Ham F-12). Se utilizará en todo momento material estéril y puntas con filtro para evitar posibles contaminaciones. A continuación el tejido será homogeneizado con ayuda de bisturí estéril y añadiendo 1ml de Trizol (Invitrogen, City, USA) por cada 50-100mg de tejido para ser posteriormente transferido a un eppendorf y criopreservado a -80ºC hasta el momento de la extracción de RNA y el estudio de la expresión génica. La recogida de las lesiones rojas que tendrán lugar durante la primera y segunda laparoscopia serán procesadas de la misma forma que las muestras de endometrio recogidas a lo largo del estudio. Histología convencional para análisis morfológico de las biopsias Las técnicas mencionadas consisten básicamente en la tinción con eosina-hematoxilina de las biopsias incluidas en parafina tras los sobradamente conocidos protocolos de corte, deparafinizado, deshidratado, montaje etc, y que pretenden comprobar la existencia de endometrio y estroma en fase secretora. Las particularidades del tejido a analizar no son obstáculo para este grupo de investigación, pues la histología de la endometriosis y la histología clásica, son procederes establecidos hace 60 años y que conocemos a la perfección, pudiendo identificar morfológicamente y sin ningún tipo de dudas los componentes del tejido endometrial. PCR cuantitativa para determinar la expresión génica de marcadores angiogénicos tras el tratamiento con Quinagolida. El perfil de expresión génica en el endometrio será comparado pre, durante y post tratamiento con Quinagolida. Así mismo se llevará a cabo el estudio comparativo de la expresión génica en las lesiones endometriósicas rojas antes del tratamiento con la Quinagolida (lesiones recogidas durante la laparoscopia diagnóstica) y tras el tratamiento con Quinagolida (lesiones recogidas durante la segunda laparoscopia). La técnica de PCR a tiempo real o QF-PCR consiste en la determinación ciclo a ciclo de la intensidad fluorescente que generan los fluoróforos unidos al cDNA en amplificación. Su principal ventaja con respecto a la PCR convencional radica en que al poder ser monitorizada durante todo el proceso evita errores de cuantificación por saturación de producto resultante. Para el desarrollo de esta técnica utilizaremos la tecnología TaqMan que consiste en el uso de dos sondas que hibridan en las secuencias específicas. El empleo de sondas TaqMan garantiza la obtención de ensayos de PCR altamente específicos, de una eficiencia de amplificación cercana al 100% que además permite evaluar numéricamente con la más alta precisión, la cantidad de moléculas de material genético presente en cada muestra. Por ello, previa extracción de ARN y conversión a cDNA mediante transcripción reversa de los mRNA extraídos, cuantificaremos a tiempo real mediante la técnica de QF-PCR-TaqMan: 1. la expresión de las molécula Nocht4 y Wnt1, como respectivos marcadores y controladores del inicio o bloqueo de la neoangiogénesis vascular (45-46) es decir de la ramificación vascular indicativa del estímulo angiogénico inicial positivo (Notch4) o negativo (Wnt1) existente. 2. la expresión de VEGF y su receptor VEGFR-2 como elementos reguladores entre otros de los procesos quimiotácticos, y migratorios (47) que continúan y regulan de modo amplio el estímulo angiogénico positivo total. 3. la expresión de angiopietina 1 (Ang1) liberada para la estabilización del vaso neoformado (48) y que será utilizada como indicadora de estímulo angiogénico inexistente. 4. la expresión del D2R para estudiar el efecto de la Quinagolida sobre estos receptores. Para la normalización y cuantificación de los resultados, utilizaremos como controlador interno la expresión de un gene constitutivo que se expresa en la misma cantidad independientemente del ambiente que las rodee. Nos referimos al 18S ribosómico. Por ello, no necesitaremos cuantificar el número de células exacto por muestra para estimar los valores de expresión de los mRNA a amplificar en cuestión sino que dado un rango de equivalentes de cDNA/mRNA adecuado, los valores de expresión de los genes de interés vendrán en función de la expresión de los genes constitutivos amplificados en paralelo ya que el cDNA obtenido de los genes constitutivos puede ser tomado como medida directa del número de células existentes. Los productos finales se analizarán con el software específico de sistema de detección de secuencias 7900HT versión 2.2.2 (PE Applied Biosystems) y los datos serán representaron mediante el valor medio relativo del gen analizado y normalizado con respecto al valor correspondiente del gen de la subunidad 18S del RNA ribosómico utilizando el método 2-??Ct. Análisis estadístico El perfil de expresión génica del será comparado pre, durante y post tratamiento con Quinagolida, en el caso del endometrio eutópico, niveles de Ca125 y niveles de PRL. En el caso de las lesiones endometriósicas, el perfil génico será comparado pre y post tratamiento con Quinagolida. Para ello, el análisis estadístico se llevará a cabo mediante el soporte informático GraphPad Instat V3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). La Media, SE y SEM será calculada. Se considerará estadísticamente significativa una p<0.05.