Descubrimiento y caracterización de la estefenantrina como fármaco para la Distrofia Miotónica Tipo 1

Resumen

La Distrofia Miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad autosómica dominante cuyos principales síntomas incluyen miotonía (incapacidad para relajar el músculo tras una contracción voluntaria), degeneración muscular, cataratas, diabetes, arritmias cardiacas y déficit cognitivo entre otros. La causa genética de la enfermedad radica en la expansión del trinucleótido CTG en el extremo 3’ no traducido del gen proteina kinasa de la distrofia miotónica (DMPK). La expansión de este trinucleótido provoca la ganancia de función tóxica del RNA al transcribirse la región expandida. El RNA portador de las expansiones tóxicas de CTG se pliega sobre sí mismo formando una horquilla de doble cadena que queda retenida en el núcleo donde secuestra proteínas nucleares como factores de transcripción o de splicing, entre los que destaca la proteína Muscleblind like 1 (MBNL1). La presencia de las repeticiones también altera el patrón de fosforilación de ciertas proteínas, como CELF1, otro factor de splicing alterado en presencia de las repeticiones debido principalmente a un aumento en su fosforilación lo que provoca un aumento en su actividad. Estas alteraciones provocan cambios en el patrón splicing de varios transcritos, lo que parece tener una relación directa con síntomas de la enfermedad. Hasta la fecha no se ha descrito ningún tratamiento eficaz para esta enfermedad, por lo que nuestro objetivo fundamental fue la búsqueda de un fármaco para la DM1 utilizando el rastreo de compuestos in vivo. En nuestro laboratorio disponíamos de un modelo en Drosophila de DM1 que reproducía los principales síntomas de la enfermedad. Para llevar a cabo el rastreo de compuestos en Drosophila diseñamos un sistema basado en el uso de un espliceosensor (un suceso de splicing que se conocía alterado en la enfermedad fusionado al gen reportero luciferasa). El uso de estas moscas espliceosensoras permitió realizar un rastreo automatizado de alto rendimiento, consiguiendo rastrear 1000 compuestos semanales, lo que constituye el rastreo de compuestos en Drosophila de mayor rendimiento descrito hasta la fecha. Utilizando este sistema de rastreo identificamos la estefenantrina como compuestos positivo capaz de mejorar el suceso de splicing. La estructura planar con anillos aromáticos de la estefenantrina parecía indicar un posible mecanismo de acción basado en la unión de la estefenantrina al RNA portador de las repeticiones CUG. Este mecanismo de acción se confirmó mediante un ensayo de retardo en gel en el que se demostró como la estefenantrina se unía a las repeticiones CUG de un modo dosis dependiente. Si la estefenantrina es capaz de unirse al RNA tóxico, era de esperar que fuera también capaz de revertir la formación de agregados nucleares de repeticiones CUG en Drosophila. Conforme a lo esperado, se observó una reducción del 20% en el porcentaje de células con agregados de CUG en moscas modelo de DM1 tratadas con estefenantrina respecto a las moscas modelo tratadas con el vehículo. Utilizando este mismo modelo de DM1 en mosca analizamos la capacidad de la estefenantrina para rescatar un fenotipo funcional, las moscas modelo presentan menor longevidad que las moscas control. Al tratar las moscas DM1 con estefenantrina observamos un aumento en la longevidad similar al de las moscas control. Posteriormente analizamos el efecto de la estefenantrina en fibroblastos derivados de pacientes de DM1, en los que observamos un aumento en el número de células sin agregados nucleares así como una disminución en el número de agregados por célula tras tratar los fibroblastos con la estefenantrina. Tras diferenciar los fibroblastos a mioblastos observamos como el tratamiento con estefenantrina revierte de manera dependiente de dosis alteraciones en el splicing de transcritos descritos en los mioblastos DM1. Por último validamos el efecto de la estefenantrina en un modelo murino de DM1 en el que observamos como la miotonía presente en los pacientes disminuía tras el tratamiento con estefenantrina. Además a las concentraciones a las que la estefenantrina resultó efectiva en ratones no se observaron signos de toxicidad. En conjunto, hemos desarrollado un sistema de rastreo de alto rendimiento in vivo utilizando Drosophila que ha permitido la identificación de la estefenantrina como posible fármaco para la DM1, ya que es capaz de revertir síntomas de DM1 tanto en moscas modelo, como en cultivo celular y en ratones.