Development and application of (bio)analytical methodologies in capillary electrophoresis. Enantioselectivity considerations

Resumen

El desarrollo de nuevos fármacos es un proceso largo, complejo y costoso que incluye la evaluación en diferentes etapas de propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la nueva molécula. En las primeras etapas del desarrollo de un fármaco es habitual el uso de métodos in vitro para el cribado de alto rendimiento de las propiedades de nuevas moléculas, con el objetivo de obtener datos preliminares sobre la potencial actividad farmacológica de una molécula y sobre su farmacocinética. Cuando se emplean moléculas quirales, tanto sus propiedades farmacocinéticas como las farmacodinámicas pueden presentar un cierto grado de enantioselectividad debido a la interacción con biomacromoléculas ópticamente activas (Brocks, 2006), por lo que los métodos aplicados en estas primeras etapas preclínicas deben permitir la evaluación de estas propiedades de una manera enantioselectiva. Esta necesidad proviene del creciente interés de la industria farmacéutica en el desarrollo de formulaciones enantioméricamente puras, y también de las normativas en torno a medicamentos racémicos, que indican que el control de calidad realizado sobre estos fármacos también debe ser enantioselectivo (Food and Drug Administration, 1992; European Medicines Agency, 1993). La electroforesis capilar (CE, del inglés capillary electrophoresis) es una técnica analítica conveniente para abordar estos estudios preclínicos. Proporciona ventajosas posibilidades para el análisis quiral de moléculas pequeñas y para la evaluación en línea de numerosos procesos farmacocinéticos y farmacodinámicos, como la unión de fármacos a las proteínas plasmáticas o su comportamiento en diferentes reacciones enzimáticas. Sus principales características, extremadamente interesantes para estas aplicaciones, son rapidez de análisis, bajo consumo de reactivos y muestras, facilidad de automatización, elevadas eficacias de pico y bajo impacto medioambiental (Lin y col., 2003). El principal objetivo de esta Tesis es el desarrollo y aplicación de metodologías electroforéticas para la evaluación enantioselectiva in vitro de propiedades farmacológicas de medicamentos, con el fin de proporcionar a la industria farmacéutica alternativas rápidas y fiables en las fases preclínicas del desarrollo de nuevos fármacos. Esta Tesis se divide en tres bloques principales: desarrollo de métodos y estudios teóricos para la separación quiral de xenobióticos mediante electroforesis capilar (Artículos I-IV), evaluación de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas (Artículos V-VII) y estudio de reacciones enzimáticas empleando microanálisis mediante electroforesis (EMMA, del inglés electrophoretically mediated microanalysis) (Artículos VIII-X). Los dos primeros trabajos incluidos en esta Tesis son estudios teóricos sobre la capacidad de enantioreconocimiento de la ?-ciclodextrina altamente sulfatada (HS-?-CD, del inglés highly sulfated ?-cyclodextrin), potente selector quiral que se ha utilizado en una gran parte de las separaciones quirales desarrolladas en esta Tesis. En el Artículo I se han estimado constantes de unión aparentes entre la HS-?-CD y los enantiómeros de ocho fármacos psicoactivos empleando cromatografía electrocinética y la técnica del llenado completo del capilar (EKC-CFT, del inglés electrokinetic chromatography-complete filling technique). Los datos experimentales de movilidad electroforética de ambos enantiómeros se representaron frente a la concentración de ciclodextrina empleando un modelo de ajuste no lineal que permite la estimación de constantes de unión aparentes y movilidades límite. A partir de estas estimaciones se calcularon las enantioselectividades termodinámica (?t) y electroforética (?e) del proceso de separación. Los resultados mostraron que esta ciclodextrina se une fuertemente a los enantiómeros de los ocho fármacos básicos seleccionados, con elevada enantioselectividad en la mayoría de los casos. Las constantes aparentes de unión de la HS-?-CD a los fármacos estudiados son iguales o mayores que las descritas en la bibliografía para otros compuestos (Vaccher y col., 2005, Lipka y col., 2007). Ambas enantoselectividades, termodinámica (relacionada con las diferencias entre las constantes de unión aparentes de ambos enantiómeros) y electroforética (debida a las diferentes movilidades de los complejos enantiómero-ciclodextrina), resultaron ser responsables de la separación quiral con HS-?-CD, aunque con una mayor contribución de ?t. Sin embargo, en uno de los casos en el que no se vio enantioselectividad termodinámica, los enantiómeros se resolvieron completamente debido únicamente a la enantioselectividad electroforética. Por otro lado, el uso de la técnica del llenado completo del capilar para la evaluación de constantes de unión se presenta en esta Tesis como una alternativa a la cromatografía electrocinética convencional con un ahorro en selector quiral en torno al 99%. El segundo Artículo incluido en esta Tesis es un estudio de relación cuantitativa estructura-actividad que modela la capacidad de enantioreconocimiento de la HS-?-CD para compuestos básicos en EKC, relacionando la resolución obtenida para cuarenta xenobióticos (fármacos y plaguicidas) con algunas de sus propiedades estructurales. Este trabajo proporciona a los investigadores en el campo de las separaciones quirales una alternativa a los procedimientos habituales de ensayo y error para el desarrollo de métodos enantioselectivos. Se llevó a cabo una regresión de mínimos cuadrados parciales discriminante sobre una variable respuesta (DPLS1, del inglés discriminant-partial least squares) empleando como vector y un valor categórico de resolución (Rs) y como matriz X las propiedades estructurales de los xenobióticos. Únicamente se seleccionaron cuatro variables estructurales como significativas en el modelo final: logaritmo del coeficiente de partición octanol-agua estimado a pH 7,4 (lgD), área superficial polar (PSA), número de dadores (HBD) y aceptores (HBA) de enlaces de hidrógeno. A partir de los coeficientes no escalados del modelo, se obtuvo una ecuación explícita que relaciona el valor categórico de Rs con las cuatro variables estructurales seleccionadas: Rs = 2,354 + 0,095lgD – 0,008PSA – 0,159HBD – 0,137HBA. El modelo seleccionado presentó una varianza explicada del 72,4%. Para aquellos xenobióticos cuya Rs predicha no es muy elevada, que puede interpretarse como posible separación quiral pero sólo en determinadas condiciones experimentales, se propuso una optimización multivariante de las tres condiciones experimentales más influyentes en la enantioseparación (concentración de ciclodextrina, pH del tampón de separación (BGE, del inglés background electrolyte) y temperatura del capilar), a través de un diseño experimental Box-Behnken y un ajuste posterior de los resultados experimentales a un modelo PLS2, que permite la estimación del tiempo de migración y la resolución para cada conjunto de condiciones experimentales. El Artículo III es una aplicación de la enantioseparación del antidepresivo fluoxetina con HS-?-CD al análisis quiral de tres formulaciones farmacéuticas. Las condiciones de separación se optimizaron para evitar una interferencia de la matriz y se obtuvo un método de separación adecuado mediante EKC-CFT que permite la cuantificación de ambos enantiómeros de fluoxetina en menos de 2 minutos con un valor de Rs de 2,4. Se llevó a cabo una validación parcial del método quiral siguiendo las indicaciones de la International Conference on Harmonization (ICH) y de la US Pharmacopeia sobre identidad, linearidad, precisión y exactitud. Se obtuvieron buenas características analíticas: coeficientes de determinación (R2) de 0,996 para las curvas de calibrado de ambos enantiómeros, desviaciones estándar relativas (RSD, del inglés relative standard deviation) inferiores al 20%, obtenidas en condiciones de precisión intermedia, y recuperaciones de 92 ± 13 y 105 ± 6 % para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para todas las muestras se obtuvo un contenido en fluoxetina racémica dentro de las especificaciones de la US Pharmacopeia (20 mg ± 15%), con relaciones estereoisoméricas en torno a 1. Así pues, en esta Tesis se ha demostrado la idoneidad de la HS-?-CD para la enantioseparación de fármacos básicos, no sólo con estudios teóricos sino también con una aplicación al análisis quiral de productos farmacéuticos. En el Artículo IV se describe una aplicación de la electroforesis capilar no acuosa (NACE, del inglés non-aqueous capillary electrophoresis) a la separación quiral de fármacos, llevada a cabo durante una estancia de investigación en la Katholieke Universiteit of Leuven. Este trabajo responde al interés en desarrollar metodologías basadas en sistemas no acuosos que sean capaces de disolver y analizar nuevos principios activos que sean insolubles en medios acuosos o metanólicos. Muchos fármacos en desarrollo sugeridos por aplicación de la química combinatoria presentan baja solubilidad en agua debida a un elevado peso molecular. Si una molécula objetivo poco soluble en medios acuosos presenta buena potencia y baja toxicidad, puede resultar de interés continuar en fase de desarrollo a pesar de esta baja solubilidad y en estos casos se requieren métodos de análisis quiral para su control analítico. En este trabajo se propuso el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como alternativa a los BGEs de naturaleza alcohólica más comúnmente empleados, debido a su baja volatilidad y toxicidad y mejores propiedades disolventes para moléculas poco polares. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la enantioseparación en DMSO se encuentra desfavorecida debido a que las fuerzas intermoleculares responsables del enantioreconocimiento son más débiles en medios orgánicos (Chankvetadze y Blaschke, 2001). Se llevó a cabo la separación quiral de tres fármacos, verapamilo, pindolol y fenfluramina, mediante NACE y empleando una optimización univariante para la selección de las mejores condiciones experimentales. Finalmente, se seleccionaron BGEs basados en DMSO y que contenían proporciones variables de metanol (0-30%), HAc 0,5-1 M, NH4Ac 125 mM y carboximetil-?-ciclodextrina 40 mM, con una temperatura de separación de 15 ºC y un potencial aplicado de 30 kV. Empleando estas condiciones se obtuvieron valores de Rs de 1,5; 2,0 y 1,2 para verapamilo, pindolol y fenfluramina, respectivamente. La corriente fue estable durante todas las separaciones llevadas a cabo, a pesar de que uno de los principales problemas de NACE son los frecuentes cortes de corriente. Los Artículos V-VII de esta Tesis se refieren a la evaluación enantioselectiva de una importante propiedad farmacocinética al nivel de la distribución de fármacos, la unión a proteínas plasmáticas. La cantidad de un fármaco que se une a las proteínas plasmáticas, así como la fuerza de esta unión, influyen considerablemente en la disponibilidad de los fármacos para alcanzar órganos diana y también para su eliminación. Dado que las proteínas plasmáticas son moléculas ópticamente activas, los fármacos quirales pueden presentar diferencias en las propiedades de unión de sus enantiómeros a éstas. Así pues, el desarrollo de metodologías rápidas y fiables para la evaluación in vitro de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas resulta de gran interés para la investigación en la industria farmacéutica. La proteína más abundante en el plasma humano es la albúmina (HSA, del inglés human serum albumin), que presenta un elevado grado de enantioselectividad en su unión a fármacos. En esta Tesis se ha evaluado la unión enantioselectiva de fármacos a HSA y al total de las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración seguida de análisis quiral mediante EKC. En la ultrafiltración se filtra una mezcla pre-equilibrada de fármaco y proteína a través de una membrana que retiene la proteína y sólo permite el paso de la fracción libre de fármaco. Esta fracción libre se analiza posteriormente, en este caso empleando EKC quiral. El Artículo V destaca algunos aspectos débiles de las metodologías experimentales y modelos matemáticos previamente publicados para el estudio de la unión a proteínas plasmáticas (Katrahalli y col., 2010; Fielding y col., 2005), y propone una estrategia novedosa para una evaluación fiable de la unión a proteínas. Se lleva a cabo una amplia discusión acerca de los diferentes modelos matemáticos de unión a proteínas, empleando como ejemplo la unión enantioselectiva del antidepresivo fluoxetina a HSA. El análisis enantioselectivo de fluoxetina se realizó empleando HS-?-CD como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, en un tampón fosfato 30 mM de pH 7,0. La temperatura y el potencial de separación se fijaron a 30 ºC y 15 kV respectivamente. La estrategia propuesta implica trabajar en condiciones cercanas a las fisiológicas, por tanto, manteniendo el cociente entre la concentración de fármaco (D) y la de proteína (P) por debajo de 0,5; y P cerca del nivel fisiológico (en torno a 475 ?M). En estas condiciones, se puede emplear un modelo simple de unión que considera que sólo se ocupa un tipo de sitio de unión en la molécula de proteína y que la estequiometría de dicha unión es 1:1, siempre y cuando estas consideraciones se confirmen a través de otras ecuaciones. Además, los datos fueron evaluados con el fin de detectar y eliminar valores anómalos que pudieran afectar a la fiabilidad de las estimaciones. Se estimaron para ambos enantiómeros de fluoxetina constantes de unión enantiómero-proteína (K1), así como la enantioselectividad en el proceso de unión, definida como el cociente entre ambas constantes. Finalmente, se estimó para ambos enantiómeros el porcentaje de unión a proteína (PB%, del inglés protein binding), que es un parámetro interesante desde un punto de vista farmacocinético. Se obtuvieron porcentajes de 95,2 y 90,0% para el primero y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Se obtuvo una enantioselectividad en torno a 2 en favor del primer enantiómero eluído. Todavía en el campo de las interacciones enantioselectivas fármaco-proteína, los Artículos VI y VII estudian la unión enantioselectiva del hipnótico zopiclona y del antidepresivo nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas, de nuevo mediante ultrafiltración y EKC quiral. En el Artículo VI, la enantioseparación de zopiclona con carboximetil-?-ciclodextrina (CM-?-CD) se ajustó para el análisis de la fracción de fármaco libre post-ultrafiltración. Se empleó como selector quiral una disolución de CM-?-CD 30 mM en tampón Tris 50 mM de pH 6,0, que se inyectó en el modo de llenado parcial del capilar aplicando una presión de 0,5 psi durante 99 s antes de la inyección de muestra. La separación quiral se llevó a cabo a 25 ºC aplicando un potencial de 15 kV. Los modelos matemáticos y diseños experimentales desarrollados en el Artículo V se aplicaron aquí para el cálculo de las constantes de unión, enantioselectividad y porcentaje de unión a las proteínas plasmáticas. Los valores de PB% a HSA fueron 47 y 36% para S- y R-zopiclona, respectivamente, mientras que los valores de PB% al total de las proteínas plasmáticas fueron 45 y 49%, respectivamente. Estos valores concuerdan con el PB% descrito en la bibliografía para zopiclona racémica, en torno al 45% (Gaillot y col., 1983; Agencia Española del Medicamento, 2011). La unión enantioselectiva de nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas se evaluó en el Artículo VII, en este caso usando heptakis-(2,3,6-O-metil)-?-ciclodextrina 30 mM como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, con el mismo BGE y potencial de separación del Artículo VI pero con una temperatura del capilar de 50 ºC. El diseño experimental para la obtención de curvas de calibrado y análisis de muestras se repitió en dos sesiones independientes con el fin de evaluar la precisión inter-día del procedimiento. Como no se encontraron diferencias significativas entre los datos de ambas sesiones de trabajo, todos los datos se emplearon en conjunto para realizar las estimaciones. El PB% a HSA estimado fue de 40 y 63% para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para la unión al total de proteínas plasmáticas, los valores estimados fueron de 63 y 64% respectivamente. Comparando estos valores, puede concluirse que el segundo enantiómero eluído de la nomifensina se une principalmente a la HSA, mientras que el primero se une también a otras proteínas plasmáticas. El diseño experimental y los modelos matemáticos propuestos en esta Tesis para una estimación fiable de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración y EKC han demostrado ser una herramienta robusta que permite la obtención de buenas estimaciones in vitro en condiciones cercanas a las fisiológicas, proporcionando por lo tanto datos valiosos desde un punto de vista farmacocinético. En esta Tesis se han estimado datos de unión enantioselectiva de fluoxetina, zopiclona y nomifensina a las proteínas plasmáticas, completando la información disponible en la bibliografía sobre estos fármacos. La tercera parte de esta Tesis se dedica al desarrollo de reacciones enzimáticas en el interior del capilar empleando la metodología EMMA. En EMMA los reactivos se introducen secuencialmente en el capilar electroforético y se dejan mezclar y reaccionar durante un tiempo determinado. Después se lleva a cabo la separación de sustratos, enzimas y productos mediante electroforesis. La principal ventaja de la metodología EMMA es que la reacción tiene lugar a escala de nanolitros, por lo que el consumo de reactivos y muestras es extremadamente bajo. Además, es una metodología completamente automatizada, ya que la reacción y la separación tienen lugar en una única etapa en el interior del capilar, lo que constituye otra importante ventaja para su empleo en procedimientos de cribado. En el Artículo VIII se desarrolla una metodología de cribado mediante EMMA para la evaluación de inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE), y se aplica al estudio de cinco fármacos de actividad inhibidora conocida. Para la optimización de condiciones del método se empleó tacrina como fármaco modelo. El avance de la reacción enzimática de hidrólisis de acetiltiocolina en presencia de AChE y de los diferentes inhibidores se determinó midiendo el área de pico del producto de reacción tiocolina. Se llevó a cabo una inyección en “sándwich”, introduciendo una zona de sustrato entre dos zonas de enzima. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple, con un tiempo de incubación de 2 minutos. El tampón empleado para la reacción y la separación fue borato-fosfato 30 mM a pH 8,0; la temperatura del capilar se fijó a 37 ºC y el potencial de separación a 15 kV. Debido a la dilución de los solutos en la metodología EMMA, se realizó una corrección en los cálculos para obtener una buena exactitud en los resultados. Se estimó un factor de dilución comparando la potencia inhibitoria de la tacrina calculada en este trabajo con la descrita en la bibliografía empleando el método de referencia (Andrisano y col., 2001). Dicho factor se aplicó posteriormente a todos los cálculos realizados. La metodología de cribado propuesta ha demostrado ser de utilidad para la estimación de constantes de inhibición, potencia inhibitoria, una aproximación cualitativa al mecanismo de inhibición y el porcentaje de inhibición de tacrina, edrophonium, neostigmina, piridostigmina y eserina. Los resultados del cribado muestran que, de acuerdo con su porcentaje de inhibición en condiciones prefijadas, el orden de potencia inhibitoria para estos compuestos es tacrina > edrophonium > neostigmina > eserina > piridostigmina. Esta metodología de cribado, con un tiempo de análisis inferior a 5 minutos, puede ser empleada para la evaluación de nuevas moléculas que sean inhibidores potenciales de la AChE. Continuando con el uso de la metodología EMMA para la evaluación de interacciones fármaco-enzima, los Artículos IX y X son estudios de metabolismo enantioselectivo empleando diferentes isoformas del citocromo P450. En estos estudios, el capilar actúa simultáneamente como reactor y como sistema de separación quiral, de modo que proporciona información enantioselectiva a través de un ensayo rápido y completamente automatizado. La separación quiral se lleva a cabo en ambos casos usando HS-?-CD y la técnica del llenado parcial del capilar. El Artículo IX hace referencia al metabolismo enantioselectivo de verapamilo, bloqueante de canales de Ca+2, mediante CYP3A4, la isoforma más importante del citocromo P450 en humanos. En este artículo se consideraron diferentes posibilidades para el ensayo mediante EMMA y se optimizaron variables experimentales previamente al cálculo de los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para el metabolismo enantioselectivo del verapamilo. Las condiciones experimentales seleccionadas incluyeron una inyección tipo “sándwich” de la zona de sustrato entre dos zonas de enzima, y la inyección de dos zonas de tampón de incubación antes y después del “sándwich” con el fin de proporcionar a la enzima su medio de reacción adecuado. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple durante un tiempo de incubación de 5 min. A continuación se llevó a cabo la separación de toda la mezcla de reacción incluyendo los enantiómeros del verapamilo y su metabolito principal norverapamilo en el mismo capilar, empleando las siguientes condiciones experimentales: fosfato 50 mM de pH 8,8 como BGE, HS-?-CD al 2,5% inyectada a 10 psi/2 min, 25 ºC y separación a 20 kV con una pequeña presión de 0,2 psi con el fin de acortar los tiempos de migración. El resultado es una metodología completamente automatizada que permite la evaluación enantioselectiva del metabolismo de verapamilo por el CYP3A4 en menos de 35 minutos, incluyendo el acondicionamiento previo del capilar, inyección, incubación y separación. A partir de la ecuación de Michaelis-Menten se calcularon parámetros cinéticos (Km y Vmax) para el metabolismo global de verapamilo por el CYP3A4. Los valores de Km estimados fueron de 51 ± 9 y 47 ± 9 ?M para S- y R-verapamilo, respectivamente, mientras que los valores de Vmax obtenidos fueron 22 ± 2 y 21 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 para S- y R-verapamilo, respectivamente. También se calcularon para cada enantiómero valores de aclaramiento intrínseco, definido como la cantidad de plasma de la cual el fármaco es eliminado por unidad de tiempo, y estimado in vitro como el cociente entre Vmax y Km (Kroemer y col., 1992). El metabolismo enantioselectivo de fluoxetina mediante otra isoforma del CYP450, CYP2D6, se evaluó en el Artículo X siguiendo la misma metodología que en el trabajo anterior. Las condiciones del ensayo EMMA empleadas en el Artículo IX se aplicaron directamente, mientras que las condiciones de separación se ajustaron con el fin de separar los enantiómeros de fluoxetina y su metabolito principal norfluoxetina. Se estudió la influencia de la variable experimental más importante en la enantioseparación, la concentración de HS-?-CD, y se seleccionó una concentración final de 1,25% para la separación de la mezcla de reacción. Las otras condiciones de separación fueron las empleadas en el Artículo IX. Se estimaron parámetros cinéticos mediante un ajuste no lineal de los datos experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten. Los valores de Km obtenidos fueron de 30 ± 3 ?M para S-fluoxetina y 39 ± 5 ?M para R-fluoxetina, mientras que las Vmax estimadas fueron de 28,6 ± 1,2 y 34 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 para S- y R-fluoxetina, respectivamente. El ensayo cinético fue repetido empleando un único enantiómero (R-fluoxetina) en lugar de la mezcla racémica. Se obtuvieron resultados similares, lo que indica que el uso del racemato es una buena opción para la obtención de estimaciones enantioselectivas. En esta Tesis se ha demostrado la utilidad de EMMA como metodología de cribado para la evaluación in vitro, enantioselectiva o no, de interacciones fármaco-enzima. Los métodos desarrollados permiten la estimación de parámetros cinéticos y de inhibición mediante ensayos rápidos con un bajo consumo de reactivos y muestras. El acoplamiento de la metodología EMMA con la enantioseparación de sustratos y productos en una única etapa llevada a cabo en el equipo de electroforesis capilar proporciona valiosa información enantioselectiva sobre los procesos farmacocinéticos o farmacodinámicos evaluados. Todos los métodos propuestos y aplicados en esta Tesis (separaciones quirales, modelos de predicción, evaluación enantioselectiva de la unión a proteínas e interacciones fármaco-enzima) son de aplicación en la industria farmacéutica para la obtención de información útil in vitro en las fases preclínicas del desarrollo de medicamentos, y para el control de calidad enantioselectivo de materias primas, intermedios de síntesis y productos finales. Referencias: - Andrisano, V., Bartolini, M., Gotti, R., Cavrini, V., Felix, G. (2001) Determination of inhibitors¿ potency (IC50) by a direct high-performance liquid chromatographic method on an immobilised acetylcholinesterase column. 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