Caracterización molecular del mecanismo de patogénesis de las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis activas contra insectos coleópteros

Resumen

Los bioinsecticidas basados en Bacillus thuringiensis (Bt) constituyen una herramienta de gran valor para el control de plagas de insectos, ya que presentan una forma de aplicación muy específica e inocua para los usuarios y el medio ambiente. Entender, tanto el mecanismo de toxicidad de estos bioinsecticidas como la respuesta desencadenada en los insectos diana, tiene como objetivo proporcionar una base útil para el desarrollo de insecticidas mejorados dirigidos contra estas importantes plagas agrícolas, permitiendo ampliar el rango y los niveles de toxicidad de las proteínas insecticidas y abordar problemas como la aparición de resistencia. La presente tesis se ha centrado en el estudio del modo de acción de las toxinas Cry de Bt en insectos coleópteros, orden en el cual el modo de acción de este bioinsecticida está poco estudiado. Para ello se ha escogido dos especies de insecto relevantes en este orden: la especie modelo Tribolium castaneum por su condición de plaga, la disponibilidad de la secuencia de su genoma y las numerosas herramientas genéticas y genómicas desarrolladas en dicho organismo que facilitan enormemente el análisis funcional y Leptinotarsa decemlineata, una de las plagas más importantes a nivel mundial en este orden. En T. castaneum se evaluó la actividad insecticida de diferentes cepas de Bt y se realizó un análisis proteómico global en las larvas del insecto después de ser tratadas con las cepas de Bt productoras de las toxinas Cry3Ba y Cry23/37, que resultaron activas, con el objetivo de identificar proteínas diferencialmente reguladas en respuesta a los tratamientos. Tres proteínas del insecto aumentaron tras los tratamientos y pueden participar en la defensa del insecto y la respuesta inmune, siendo una proteína de hemolinfa de unión a odorantes la que más aumentó. También cabe destacar el papel de la apolipoforina III en la respuesta inmune, cuya actuación vía activación de la cascada de la profenoloxidasa se ha demostrado. Cuatro proteínas disminuyeron tras los tratamientos y pueden estar implicadas en el metabolismo y desarrollo del insecto. También en T. castaneum, se identificaron proteínas de unión de la toxina Cry3Ba en el intestino de las larvas y se confirmó que una E-cadherina y un simportador de sodio-soluto son receptores funcionales de ésta. Un fragmento del simportador que contenía el epítopo de unión a toxinas Cry en otros insectos incrementó la susceptibilidad de las larvas al ser suministrado conjuntamente con la toxina Cry3Ba, confirmando la implicación por primera vez de un simportador de sodio en el modo de acción de Bt. En L. decemlineata, se confirmó la relevancia del motivo de reconocimiento de la toxina Cry3Aa de Bt, tóxica para este insecto, por una metaloproteasa tipo ADAM presente en el epitelio intestinal de las larvas, tanto en la proteólisis de la toxina asociada a la membrana intestinal como en su actividad insecticida. A su vez, la prohibitina 1 presentó capacidad de unión a esta toxina, y resultó ser una proteína esencial para las larvas de este insecto. El tratamiento combinado de la toxina Cry3Aa junto con el silenciamiento del gen codificante de la prohibitina 1 produjo un efecto tóxico sinérgico que puede ser utilizado para el control de esta plaga.