Aislamiento, cultivo, caracterización y maduración de células indiferenciadas desde biopsias testiculares humanas

Resumen

En el testículo existe una población de células pluripotentes, las Espermatogonias Stem Cells (SSC), responsables de la autorrenovación y la diferenciación, manteniendo así la espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso en el cual la espermatogonia sufre una serie de divisiones hasta originar el espermatozoide, que son las células fundamentales para transmitir la información genética a las generaciones futuras. Recientemente, han sido publicados una serie de estudios mostrando la posibilidad de generar células pluripotentes a partir de biopsias testiculares humanas de individuos adultos (Conrad et al., 2008; Kossack et al. ,2008). Los resultados obtenidos en éstos trabajos en humanos parecen indicar que las células obtenidas de las biopsias testiculares (las espermatogonias) sufren una reprogramación en cultivo, pasando a expresar marcadores embrionarios y pudiéndose diferenciar a las tres capas germinales y formar teratomas. En el presente proyecto proponemos demostrar la generación de líneas celulares de espermatogonias humanas desde las biopsias testiculares diagnósticas realizadas rutinariamente a pacientes con azoospermia obstructiva. Se trata de demostrar la prueba de concepto para su aplicación clínica en la preservación de la fertilidad en los niños que debido a su tratamiento oncológico deben recibir quimio/radioterapia resultando en la detención de la espermatogénesis. Para ello, se obtendrán líneas de espermatogonias autólogas mediante biopsia previa a su tratamiento oncológico, para luego después de su curación, ser inyectadas en testículo con el fin de recuperar la espermatogénesis en aquellos casos que se hubiera destruido. Durante el periodo de 2009-2010, se han recogido cerca de 50 muestras de biopsias testiculares de pacientes sometidos a tratamientos de Fertilización in vitro (FIV) en la Clínica IVI - Valencia. Las biopsias son realizadas con el objetivo de encontrar espermatozoides para el tratamiento de la infertilidad (ICSI). El material restante de las biopsias es donado mediante un consentimiento informado firmado por los pacientes. La muestra es transportada en hielo hasta en laboratorio , donde se empieza la digestión del material con el uso de enzimas. En primer lugar, realizamos el cultivo de células de Sertoli y a continuación, se lleva a cabo una incubación de 96 horas con factores que mantienen un ambiente favorable para la supervivencia de las espermatogonias. Tras ese período, se purifica la muestra con la utilización del anticuerpo CD49f (Conrad et al., 2008) presente en las células adheridas a la membrana basal de los túbulos seminíferos (espermatogonias). Por último, las células positivas son sembradas y mantenidas en cultivo con diferentes medios a los que se le añaden factores (GDNF, b-FGF, LIF) que mantienen la indiferenciación celular. Las líneas obtenidas poseen características similares: - Expresión de los marcadores de pluripotencia: OCT4, NANOG, SOX2 (determinado por PCR) - Expresión de los marcadores de células germinales: c-Kit, STELLA, BOULE, BLIMP1(determinados por PCR) - Ausencia de expresión de los marcadores de células germinales: GAF, VASA, DAZL, PIWIL2, PRM1, TNP2 (determinados por PCR) - Expresión de los marcadores de espermatogonias: CD49f, Thy-1 (CD90), GPR125, SSEA-1 (determinados por PCR e inmunocitoquímica) - Cultivo de Clusters celulares (medio serum-free + factores) - Microscopia Electrónica: análisis de los clusters en cultivo - Análisis del Cariotipo celular: Normal (46, XY) - FISH: presencia de 90% de células 2n. - Purificación de las células de Sertoli con Nile Red en el Cell SORTER - Análisis de Citometria: Nile Red positivas - Inmunocitoquímica: Oil Red positivas - Expresión de los marcadores de células de Sertoli: WT1, GATA-4 (determinados por PCR) - Ausencia de expresión del receptor hormonal: rFSH (determinado por PCR) - Transfección de las Líneas celulares con la proteína GFP/RPF. Con la obtención de líneas celulares de espermatogonias y células de Sertoli a partir de biopsias testiculares humanas de individuos adultos y el cultivo in vitro en laboratorio, hemos podido establecer un protocolo para aislar éstas células y mantenerlas en un ambiente favorable para su crecimiento y mantenimiento. Posteriormente, empezaremos los experimentos de co-cultivo celular, cultivando las células de Sertoli sobre una matriz de colágeno para dar base a su crecimiento, añadiremos las espermatogonias, además de hormonas como FSH y testosterona, para probar la capacidad de división celular que éstas células poseen in vitro (espermatogénesis).