Técnicas de microscopía para la mejora en resolución, obtención de seccionado óptico y medida cuantitativa de fase

Resumen

La microscopía óptica convencional alcanzó el límite en resolución que predice la difracción por medio del empleo de sofisticados objetivos de microscopio, que consiguen la captura de la información espacial en el espacio de la muestra con un ángulo de captura de prácticamente 70º en aire, esto es, aperturas numéricas (NA) de 0.9 (y mayores si existe un medio de inmersión). Existe la posibilidad de sobrepasar dicho límite o, mejor dicho, encontrar otro límite en resolución siempre que el microscopio que se emplee no pueda entenderse como un microscopio convencional. Por otro lado, los microscopios convencionales carecen de capacidad de seccionado óptico ya que, cuando se tiene una muestra tridimensional, no sólo se obtiene la imagen de la zona enfocada dentro de la misma sino que se recibe luz de todos los planos que se encuentren fuera del plano de foco. Este efecto perturba la calidad de las imágenes bidimensionales obtenidas con el microscopio reduciendo notablemente el contraste y, además, impide la realización de imágenes tridimensionales a partir de la compilación de pilas de secciones ópticas obtenidas para distintos planos de foco. Nuevamente, es posible obtener la mencionada capacidad de seccionado óptico por medio del empleo de algunos microscopios ópticos no convencionales Además en los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas alter-nativas a la microscopia convencional que son capaces de proporcionar in-formación de fase de las muestras, esto es, información de las variaciones de índice de refracción en su interior o del espesor de las mismas. Como veremos, dicha información de fase puede ser relevante en el estudio y la caracterización de distintos tipos de muestras. A pesar de que para alcanzar las prestaciones arriba mencionadas se debe aumentar la complejidad tecnológica con respecto a los microscopios convencionales, los beneficios que ello reporta justifica con creces dicha complejidad. Los objetivos de esta Memoria son múltiples. En primer lugar, se pretende aunar en un mismo marco teórico distintas técnicas pertenecientes a la microscopía óptica no convencional, en concreto, CLSM, SIM y DHM. Asimismo se mostrarán algunas de las limitaciones prácticas de las mismas. Para cada una de estas técnicas se presentarán propuestas de implementaciones alternativas así como las ventajas que representa el empleo de estos nuevos sistemas. Para llevar a cabo los objetivos arriba señalados, se comenzará tratando desde un punto de vista teórico la microscopía convencional en el Capítulo 2. Con ello, no sólo se presentará el tipo de cálculos que se requieren para la comprensión de las distintas técnicas de microscopía aquí recogidas, sino que también se podrán entender las limitaciones de la microscopía convencional de una manera estricta. En el Capítulo 3 se hará, en primer lugar, una introducción teórica acerca de la microscopía confocal de barrido. En éste realiza-remos una propuesta de un sistema de adquisición de imágenes confocales alternativo que, además, permitirá mejorar la calidad de las imágenes obtenidas. En el Capítulo 4 introduciremos la técnica SIM de manera rigurosa, pre-sentando los cálculos necesarios para la obtención de imágenes mediante este tipo de sistema. En este capítulo, distinguiremos entre los distintos sistemas que se pueden implementar y propondremos un novedoso sistema para gene-rar iluminación estructurada en el que la frecuencia del patrón de iluminación se pueda variar de una manera muy sencilla. Además, propondremos un algo-ritmo de reconstrucción alternativo para la obtención de imágenes. En el Capítulo 5 nos centraremos en la microscopía holográfica digital. Para llegar a entender el funcionamiento de este tipo de técnica, haremos una pequeña introducción teórica sobre holografía clásica y holografía digital. Esto nos permitirá entender las limitaciones de la técnica, a partir de lo cual realizaremos tanto una propuesta para mejorar sus prestaciones como un desarrollo teórico con el fin de optimizar los parámetros de captura. Por último, en el Capítulo 6, aunaremos las técnicas SIM y DHM en lo que llamaremos microscopía holográfica digital por iluminación estructurada (SI-DHM) en una propuesta novedosa para mejorar la resolución de un DHM convencional. Asimismo, pre-sentaremos un algoritmo mediante el cual se facilita la implementación práctica de esta técnica.