Cambios en la fosforilación de proteínas nucleares y cascadas de señalización inducidos por el ácido retinoico

Resumen

La vitamina A, a partir de una serie de transformaciones metabólicas, se convierte en el ácido retinoico (RA), su metabolito activo más potente biológicamente. La vitamina A y sus derivados juegan un importante papel como reguladores fisiológicos de un gran número de procesos biológicos. Concretamente, el RA posee un papel relevante en el desarrollo embrionario temprano y en la generación de varios órganos y sistemas, como es el caso del Sistema Nervioso. El RA es capaz de inducir la parada proliferativa y la diferenciación in vitro de líneas celulares de muy diferente origen, incluyendo muchos tipos celulares tumorales como el neuroblastoma. Estudios previos realizados en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y han mostrado que, además de las acciones clásicas sobre la transcripción de genes específicos, el receptor nuclear de RA (RAR), perteneciente a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas, media cambios rápidos en el estado de activación de rutas de señalización, como la ruta de PI3K/Akt y la vía de la MAP kinasa ERK. Este tipo de acciones rápidas independientes de transcripción, también llamadas no genómicas, constituyen el tema de interés principal de esta Tesis Doctoral, siendo nuestro objetivo general tratar de comprender cómo contribuyen este tipo de acciones en los procesos celulares y cómo se integran con las acciones genómicas transcripcionales para conseguir una única respuesta al RA. Un primer estudio de los intermediarios de estas rutas, mediante el empleo de fosfoanticuerpos específicos de residuo e inhibidores de las vías de señalización, demostró que la activación de PI3K/Akt y ERK por un tratamiento a tiempos cortos con RA se traduce en la fosforilación de sustratos corriente abajo (downstream), como mTOR y p70S6 en el caso de Akt, y MSK1 para ERK. Además, se estableció que ERK es activada independientemente de PI3K, aunque existe cierta relación entre ambas, pues la inhibición de PI3K con LY294002 modificaba el grado de inducción de ERK. Mediante un abordaje proteómico, se trató de identificar a aquellas proteínas nucleares que sufrían un cambio en su estado de fosforilación como consecuencia de las acciones atípicas del RA. Primeramente, se realizó una comparación de geles bidimensionales teñidos con Coomassie de fosfoproteínas nucleares de las células control y tratadas con RA. Este estudio fue ampliado con un ensayo LC-MS/MS cuantitativo empleando la metodología iTRAQ. Los resultados mostraron que el RA modifica el patrón de fosforilación de dos grandes grupos de proteínas: 1) aquellas que participan en transcripción y en la remodelación de la cromatina, y 2) las relacionadas con el procesamiento del mRNA, y dentro de ellas, sobre todo las implicadas en splicing. Además, estos resultados pudieron ser validados para algunas de estas proteínas mediante el empleo de otras metodologías. Los estudios funcionales mostraron que efectivamente el RA participa en la regulación del splicing alternativo, a través de la activación de la vía de PI3K/Akt. El mecanismo molecular podría implicar alteraciones en la unión al mRNA de algunos factores de splicing ricos en Ser y Arg (proteínas SFRS) y la promoción de la interacción entre las proteínas de splicing SF2 y U1- 70K. Por otro lado, el RA también desempeña un papel en la regulación del inicio de la traducción, que requiere de la inducción de la vía de PI3K/Akt/mTOR, responsable de fosforilar a 4E-BP1, y de la MAP kinasa ERK. Como conclusión, la activación de vías de señalización por las acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma puede regular el procesado del mRNA como parte de la respuesta orquestada por el receptor nuclear RAR.