Valoración de las neuronas NADPH-d en la corteza visualestudio experimental en rata Wístar

Resumen

Las células NADPH-diaforasa (nicotinamida adenin dinucleotido fosfatasa reducida), son células que están directamente relacionadas con la enzima óxido nítrico sintetasa (ONS), productora del óxido nítrico (ON) neuronal. Se ha podido comprobar que la NADPH-diaforasa y la ONS se han localizado en las mismas poblaciones neuronales y que su actividad es paralela a la producción de ON y GMPc. (1). De manera que, si localizamos las células NADPH-diaforasa positivas, podremos localizar indirectamente a aquéllas que producen el ON. En cuanto a su actividad enzimática, NADPH es una enzima del grupo de las deshidrogenasas, es decir, tienen la capacidad de captar el hidrógeno de una sustancia y transferirlo a otra. La habilidad de las hidrogenasas al trasladar el hidrógeno desde el sustrato es porque son consideradas como enzimas oxidativas. La sustancia que actúa como un hidrógeno aceptor es la dinucleótido adenina nicotinamida (NAD) o la dinucleótido adenina nicotinamida fosfato (NADP) o bien una flavoproteina. El ON actúa como neurotransmisor sobre todo a nivel del Sistema Nervioso Central; su mecanismo de acción parece ser que es el de participar como mensajero retrógrado intracelular (2) y por otra parte se encuentra implicado en procesos neurodegenerativos, actuando como radical libre (junto con otros) en los procesos de envejecimiento celular cuando se encuentra en cantidades excesivas en el citoplasma de dichas células (3). El ON es un neurotransmisor-neuromodulador que interviene en numerosas funciones fisiológicas, como la vasodilatación, la actividad sináptica y el desarrollo neuronal. De la gran variedad de funciones que han sido estudiadas cabe destacar: plasticidad sináptica, conexiones neuronales y muerte neuronal (4, 5, 6). La ONS es la enzima encargada de sintetizar el ON a partir de la L-arginina que produce ON y L-citrulina, necesitando dos cofactores, el oxígeno y la NADPH. La identificación de la ONS, ha hecho posible hacer un detallado mapa de esta enzima a través del S.N.C. Está demostrado que existen NADPH-d en geniculado (7), en retina (8) y en córtex visual (9). A nivel de retina de la rata Wístar , L. Palanza y cols. 2005 las han localizado a nivel de la capa nuclear interna como células amacrinas realizando un estudio de su desarrollo y evolución desde periodo postnatal hasta la madurez de la rata. Objetivos: Basándonos en este resumen bibliográfico, pretendemos localizar neuronas productoras de NO en la corteza visual primaria o V1 en ratas de una semana de vida (consideradas jóvenes), ratas de tres meses de vida (consideradas adultas) y ratas de un año de vida (consideradas viejas). Localizaremos las neuronas NADPH-d que se encuentran en el área visual primaria y analizaremos su densidad poblacional en V1 y sus cambios en relación a la edad de la rata. Estudiaremos la distribución en las capas corticales en V1 de las neuronas NADHP-d y sus cambios en relación a la edad de la rata. Determinaremos por tanto, los cambios que se producen en relación al envejecimiento cerebral en este tipo de neuronas. Metodología: Para este estudio utilizamos el cerebro de ratas Wístar, bajo un patrón de normalidad, es decir, en condiciones fisiológicas. Tras el sacrifico de la rata se obtiene el cerebro y se congela a -80 grados. Posteriormente, efectuamos cortes por congelación de los cerebros y dichos cortes los colocamos en bloques separados y sucesivos siguiendo el mapa de cerebro de rata de Paxinos G y cols (Academia Press Ed. 1999). De esta manera, se localiza el área visual primaria en los cortes obtenidos de manera que, en todo momento sabemos en qué corte cerebral (o Bregma del mapa de Paxinos) nos encontramos. Los cortes cerebrales los codificamos. De cada bloque cerebral seguimos una sistemática: sacamos un corte y lo procesamos con la técnica de Nissl, para la localización morfológica y anatómica de la zona correspondiente al estudio (con esta técnica podemos localizar el corte con el mapa de Paxinos ya que se tiñen bien los núcleos cerebrales y facilita la localización anatómica). A cada corte de Nissl le corresponden cuatro cortes consecutivos que serán procesados con la técnica histoquímica de la NADPH para marcar las neuronas a estudio, a nivel del córtex visual primario, así pues , tendremos cuatro cortes con técnica de NADPH-d que estudiaremos y corresponden a un corte de Nissl (mediante el cúal hemos localizado anatómicamente el Bregma cerebral). Posteriormente, se hacen fotografías con el microscopio a x10 aumentos del área visual primaria en cada corte teñido con técnica de NADPH-d. Para que todas las muestras sean comparables se marca un área constante en el centro de V1. Realizamos un contaje de neuronas positivas para NADHP-d y analizamos su distribución por capas dentro del área constante marcada en V1 de manera que vemos su densidad poblacional y la distribución por capas corticales.Esta sistemática la realizamos en ratas de una semana de vida, de tres meses de vida y de un año de edad. Finalmente, analizamos estadísticamente mediante medias y desviaciones típicas los resultados de la densidad poblacional neuronal en cada una de las edades y posteriormente se comparan entre ellas para evaluar los cambios que se producen en relación al envejecimiento cerebral en el área visual. Se utiliza además el test de Wilcoxon para hacer tablas de significación estadística y ver la confianza que se tiene en los datos observados. Resultados Se obtiene tablas con el contaje neuronal en cada edad de la rata según la población total neuronal y luego por separado según su orientación vertical y horizontal (teniendo en cuenta su distribución en las capas corticales). Se obtienen tablas de frecuencias absolutas y a partir de ellas tablas de frecuencias relativas en las que se calculan la medias y desviaciones estándar. En cada edad se hace un análisis estadístico de los resultados y luego comparativo entre edades tanto de densidad neuronal como de densidad de los elementos axonales encontrados. Finalmente se calcula con el test de Wilcoxon una tabla de significación estadística tanto para neuronas como para axones. Se describen además los hallazgos morfológicos encontrados en nuestras muestras. Conclusiones La realización del estudio experimental propuesto nos ha llevado a la obtención de las siguientes conclusiones: 1.- Se evidencia una disminución progresiva de la densidad de neuronas NADPH-d en el área visual primaria en las diferentes etapas de la vida de la rata Wístar. Ello coincide con la menor observación de axones. Esta disminución podría estar relacionada con el envejecimiento del área V1. 2.- Se han identificado las neuronas NADPH-d a nivel de las tres capas estudiadas en el área visual primaria con dos tipos de orientación: paralelas a la superficie de la corteza visual u horizontales y perpendiculares a la misma o verticales. Pensamos que la orientación y distribución en las capas corticales de V1 de las neuronas NADPH-d viene determinada según la función de las neuronas corticales de cada capa; en donde las neuronas NADPH-d contribuyen a la neuromodulación de la transmisión sináptica. 3.- En los tres grupos cronológicos se han encontrado mayor proporción de neuronas NADPH-d verticales a nivel de las capas superficiales de la corteza visual primaria de la rata Wístar. 4.- En los tres grupos de edad creciente se constatan las neuronas NADPH-d horizontales en un número más elevado en las capas medias y en las capas profundas de la corteza visual primaria de la rata Wístar. 5.- En el grupo de ratas recién nacidas, de forma global, las neuronas NADPH-d verticales son más numerosas a diferencia de lo que ocurre en las ratas adultas y viejas que poseen una mayor proporción de neuronas NADPH-d horizontales, dentro de una población total menor. Deducimos por ello, que se produce un cambio en la orientación de parte de las neuronas verticales como fenómeno adaptativo al envejecimiento. Ello puede ser considerado como diferencias en la plasticidad neuronal para conseguir mayor potencialidad sináptica. 6.- La relación observada en nuestro estudio de neuronas NADPH-d con los vasos y capilares sanguíneos corticales, pensamos confirma la función de estas neuronas como reguladoras del flujo sanguíneo cerebral a nivel de V1. Bibliografía: 1. Bredt DS et al. 1991. Nitric oxide synthetase protein and m RNA are discretely localizated in enuronal populations of mammalian CNS together with NADPH diaphorase. Neuron 7: 615-624. 2. Vincent SR, 1994. Nitric oxide: A radical neurotransmitter in the central nervious system . Prog Neurobiol 42: 129-160. 3. J. Rodrigo et al, 2000. El óxido nítrico: síntesis, neuroprotección y neurotoxicidad. Anales de Sistema Sanitario de Navarra, Vol23 Nº2 195-236. 4. Gally et al, 1990. The NO hipótesis: Posible effects of a short-lived, rapidly difussible signal in the development and function of the nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 87:3547-3551. 5. Edelman GM, Gally JA. 1992. Nitric oxide: Linking space and time in the brain. Proc Natl Acad Sci USA 89:11651-11652. 6. Dawson TM, Dawson VL. Nitric oxide: actions and pathological roles. Neuroscientist 1994; 99: 9-20. 7. Alicia Villena, Florentina Díaz, Lourdes Vidal, Mercedes Moreno, Ignacio Pérez de Vargas, Quantitative age-related changes in NADPH-diaphorase-positive neurons in the ventral geniculate nucleus, Neuroscience Research 46 (2003) 63 – 72 8. L.Palanza, S. Jhaveri, S. Donati, R. Nuzzi, A. Vercelli, Quantitative spatial analysis of the distribucion of NADPH-diaphorase-positive neurons in the developing and mature rat retina, Brain Research Bulletin 65 (2005) 349-360 9. A.E.Wiencken and V.A. Casagrande, The Distribution of NADPH Diaphorase and Nitric Oxide Synthetase in Relation to the Functional Compartmentes of Areas V1 and V2 of Primate Visual Cortex (2000) Oxford University Press, Departments of Cell Biology, Psycology and Ophtalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University , 37232 -2175. 10. Paxinos G, Kus L, Ashwell KX, Watson Ch, Chemoarchitectonic altlas of the rat forebrain. Academic Press Ed 1999. Paxinos G, Watson Ch, The rat brain in stereotaxic coordinates. ( cuarta edición)