Efecto de la pregabalina sobre la expresión de Fos en el tronco del encéfalo y la médula espinal en dos modelos de dolor neuropático

Resumen

En las últimas décadas, se han producido avances muy significativos en la búsqueda y hallazgo de nuevas estrategias terapéuticas contra el dolor. Esto ha sido posible gracias, en gran medida, al mayor conocimiento de los mecanismos subyacentes al dolor. Particularmente sustanciales han sido los datos obtenidos acerca del sustrato anatómico de la transmisión dolorosa y de su modulación endógena. En base a estos datos de carácter anatómico se ha ido clasificando el dolor en diferentes tipos: el dolor neuropático, cuando el origen del dolor está en el propio sistema nervioso, y el no-neuropático, cuando el origen del mismo se sitúa en estructuras anatómicas no neurales, como la piel, (el dolor nociceptivo superficial), estructuras del sistema musculoesquelético, (el dolor nociceptivo profundo), o como los órganos internos, (el dolor visceral). Sin embargo, los avances referidos no se reparten por igual entre todos los tipos de dolor mencionados. La respuesta del dolor neuropático al tratamiento con analgésicos comunes, o en muchas ocasiones incluso con opiáceos, todavía dista de ser satisfactoria. La falta de respuesta del dolor neuropático al tratamiento con analgésicos comunes, o en muchas ocasiones incluso a los opiáceos, ha llevado a los terapeutas a dirigir su mirada hacia otras soluciones farmacológicas. De entre todas las propuestas, actualmente una de las que se está reivindicando cada vez con mayor fuerza es el uso de fármacos antiepilépticos, que están demostrando ser una alternativa válida al tratamiento del dolor neuropático (McQuay et al., 1995). El mecanismo de acción de estos fármacos anticonvulsivantes es diferente al de los analgésicos tradicionales: mientras estos últimos reducen las señales aferentes procedentes tanto de de tejido sano como lesionado, los fármacos antiepilépticos podríamos denominarlos más bien antihiperalgésicos que antinociceptivos, ya que no tienen un efecto per se sobre la nocicepción sino que reducen la hiperexcitabilidad de las neuronas del asta posterior inducida por el daño tisular. Uno de los fármacos antiepilépticos que primero se probaron en el tratamiento del dolor neuropático fue la gabapentina (Dirks et al., 2002; Turan et al., 2004). En la actualidad, sin embargo, este fármaco está siendo sustituido por nuevos derivados con el fin de aumentar su eficacia y reducir sus efectos adversos, entre los que destaca la pregabalina. La pregabalina es el enantiómero S farmacológicamente activo del ácido 3-aminometil-5-metil-hexanoico, que es similar a su predecesor la gabapentina. Su mecanismo de acción no es conocido todavía con exactitud. Varios son los mecanismos celulares que se han propuesto para explicar su efecto en el tratamiento del dolor neuropático: actuar sobre receptores NMDA, canales de calcio, canales de sodio, vías monoaminérgicas, sistemas opioides y no opioides,… A pesar de su nombre y del de su molécula predecesora, la gabapentina, no tiene acción directa gabaérgica, ni bloquea la recaptación de GABA ni su metabolismo. La pregabalina, al igual que la gabapentina, se une a la subunidad proteica alfa2-delta de los canales de calcio voltaje-dependientes, lo que podría explicar su efecto antihiperalgésico (Schwarz et al., 2005). La pregabalina ha demostrado actividad antialodínica y antihiperalgésica en varios modelos de dolor neuropático en roedores (Lauria-Horner y Pohl, 2003; Field et al., 1999; Chen y Pan, 2001), observándose estos efectos con dosis de 2 á 4 veces inferiores a las de gabapentina. Además presenta una tolerabilidad mayor que con otros anticonvulsivantes, incluida la gabapentina, lo que la consolida como una opción terapéutica muy válida en el tratamiento de estos pacientes. Los acontecimientos adversos más frecuentes son: mareos, somnolencia, edemas periféricos, cefalea, visión borrosa y estreñimiento, siendo todos ellos habitualmente de intensidad leve a moderada. Aunque la pregabalina se ha empleado en diferentes tipos de dolor neuropático como la neuralgia post-herpética (Dworkin et al., 2003; Sabatowski et al., 2004), actualmente su interés se centra en su eficacia en el dolor post-quirúrgico (Dahl et al., 2004). De hecho, el dolor post-quirúrgico puede ser considerado como un tipo de dolor neuropático que podríamos considerar transitorio o reversible. Estudios preclínicos han demostrado que la incisión quirúrgica en la pata de la rata es seguida por una hiperalgesia térmica y mecánica prolongada, como expresión clínica de una sensibilización central (Whiteside et al., 2004). Estos datos ponen de manifiesto que la sensibilización del asta posterior de la médula, aunque será reversible en la mayoría de pacientes quirúrgicos, puede ser un mecanismo algésico importante en los primeros días o semanas post-intervención. Los fármacos antihiperalgésicos, como la pregabalina, se convierten de este modo en analgésicos post-quirúrgicos atractivos porque ofrecen la posibilidad de bloquear el dolor patológico, mientras que permitirían el dolor fisiológico, que sería de utilidad por su función protectora y de alerta. Asimismo, la acción de la pregabalina sería de interés en el dolor post-quirúrgico si tenemos en cuenta que el mecanismo de acción de estos fármacos anticonvulsivantes difiere por completo del de los opiáceos, por lo que evita la disminución de la motilidad intestinal, uno de los principales efectos adversos de los opioides en los pacientes post-quirúrgicos (Field et al., 1997). Estos datos experimentales han sido corroborados en el único ensayo clínico doble-ciego, controlado con placebo, en dolor postquirúrgico dental, y donde los resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado con 300 mg de pregabalina y el grupo tratado con placebo (Hill et al., 2001). A pesar de los estudios experimentales en animales con la pregabalina (Field et al., 1999; Eutamene et al., 2000, Hurley et al., 2002) y ensayos clínicos en humanos que avalan el uso clínico de esta sustancia en dolor neuropático, no hemos encontrado ningún trabajo que profundice en el sustrato anatómico en el que subyace a nivel del sistema nervioso central el efecto analgésico de esta sustancia antiepiléptica. El único trabajo que hemos encontrado que estudia el efecto que la administración de una de estas sustancias anticonvulsivantes, en concreto la gabapentina, tiene sobre la expresión del protooncogen c-fos a nivel de sistema nervisos central, se limita a la médula espinal dejando fuera del estudio niveles supraespinales (Kaneko et al., 2000). Nuestra revisión bibliográfica sobre el tema no ha ofrecido ni un solo trabajo en el que se pretenda identificar las estructuras neurales supraespinales que se activan o al menos se ven alteradas tras la administración de pregabalina en animales sanos, o con diferentes tipos de dolor neuropático. Parece, sin embargo, que la identificación de los centros troncoencefálicos que ven alterada su actividad neuronal por la administración de estas sustancias, sería de gran utilidad para una mejor compresión de sus mecanismos de acción, lo que permitiría mejorar su eficacia tanto empleado de forma individual como en posibles combinaciones con otros fármacos analgésicos. OBJETIVO Identificar los centros troncoencefálicos implicados en el circuito de modulación del dolor, en los que la administración de pregabalina provoque cambios significativos de actividad neuronal. El interés de alcanzar los objetivos propuestos radica en que los estudios clínicos demuestran que la pregabalina tiene un efecto analgésico en aquellos procesos en los que aparece dolor neuropático. Sin embargo, desconocemos los centros nerviosos a través de los cuales ejerce dicha acción antihiperalgésica. Los analgésicos tradicionales ejercen sus efectos a través de modular la actividad neuronal de los diferentes centros troncoencefálicos integrados en el denominado circuito endógeno de control del dolor. Para utilizar de forma más segura y eficaz estos nuevos fármacos es importante identificar los centros neurales cuya actividad, medida en forma de cambios en la expresión del protooncogén c-fos en el núcleo de sus células (Harris, 1998), cambia tras la administración de dichas sustancias. La realización del estudio en diferentes condiciones de estimulación algésica nos permitiría, además, conocer hasta qué punto la sustancia objeto de estudio, la pregabalina, puede bloquear a nivel del asta posterior de la médula la expresión de Fos debida a la llegada a ese nivel de las aferencias primarias dolorosas . MATERIAL Y MÉTODOS La metodología que emplearemos para desarrollar y alcanzar los objetivos planteados en este proyecto se basan en la detección mediante técnicas inmunocitoquímicas de las neuronas que expresan Fos en los centros troncoencefálicos implicados en el circuito de control del dolor, en los diferentes supuestos experimentales, así como en el asta posterior del segmento lumbar de la médula espinal. De forma más detallada el proceder experimental sería el siguiente: A) ANIMAL DE EXPERIMENTACIÓN El presente trabajo se llevará a cabo en 50 ratas albinas de la cepa Sprague-Dawley, machos, de peso aproximado de 250 g. Los animales serán mantenidos bajo condiciones estándar de laboratorio durante al menos una semana antes del comienzo de la experimentación: ciclos de 12 horas luz/12 horas oscuridad (la luz se enciende a las 8:00 a.m. y se apaga a las 8:00 p.m.), temperatura (15ºC) y humedad constantes, dieta estándar y libre acceso a la comida y el agua. B) GRUPOS EXPERIMENTALES Los animales se distribuirán en los siguientes grupos experimentales: B.1) Grupo Control Fisiológico (CFS) (n=10): Los animales de este grupo serán acostumbrados a las maniobras de manipulación que posteriormente pudieran ser necesarias durante el experimento. Estas manipulaciones serán las siguientes: - Sacar de la jaula al animal y pesarlo. - Inmovilizar al animal, durante 5 segundos, abrazándolo con una mano por debajo de las patas delanteras, al tiempo que se le cruzaban en aspa por delante de la cara, y con la otra sujetándole de la cola. Esta maniobra de inmovilización se le practicará dos veces a cada animal: la primera al terminar de pesarlo, y la segunda media hora después. Durante la primera inmovilización se inyecta intraperitonealmente (i.p.) 1 ml de suero salino. Entre una inmovilización y otra los animales permanecerán en sus respectivas jaulas. Los animales se sacrificarán a las 2 horas y media de la inyección i.p. de suero salino, es decir, a las 2 horas de la segunda inmovilización. La finalidad de este grupo es descartar que ni el estrés por la inmovilización, ni el posible dolor derivado de la inyección i.p., ni tan siquiera la distensión abdominal por la introducción de un volumen de 1 ml i.p., dé un patrón de expresión de Fos que pudiera enmascarar la expresión de Fos inducida por el estímulo aplicado, ya fuera éste analgésico o doloroso. B.2) Grupo Control Simulado Neuropático (CSN) (n=10): Similar al grupo CSF, con la salvedad de que una semana antes se le realizarán a los animales de este grupo todas las maniobras quirúrgicas necesarias para conseguir la exposición del nervio ciático, de forma que pueda ser comparable al grupo al que se le aplicará el test de la constricción mantenida del nervio ciático (Taber et al., 1969), pero evitando lesionarlo. La finalidad de este grupo es descartar que tampoco las maniobras quirúrgicas necesarias para poder aplicar el modelo de dolor neuropático propuesto por Taber et al. (1969) enmascararán la expresión de Fos inducida por la constricción del nervio. B.3) Grupo Control Pregabalina (CPG) (n=10): Las ratas de este grupo reciben, el día del experimento, una inyección i.p. de 1 ml, correspondiente a una dosis de morfina de 30 mg/kg (Eutamene et al., 2000) durante la primera inmovilización, 2 horas y media antes del sacrificio. B.4) Grupo Control Dolor Neuropático (CDN) (n=10): Similar al grupo CSN, pero con la diferencia de que los animales de este grupo sí reciben un estímulo doloroso neuropático por constricción del nervio ciático. Como ya se comentó anteriormente, el modelo de dolor neuropático elegido en este proyecto es el propuesto por Taber et al. (1969), que consiste en provocar una constricción mantenida del nervio ciático. Se realiza mediante 4 ligaduras separadas 1 mm entre sí en el tronco del nervio ciático a la altura del bíceps femoral, con una seda de 4-0. Los animales son sacrificados a la semana de la intervención. B.5) Grupo Pregabalina + Dolor Neuropático (PGDN) (n=10): Los animales de estos grupos reciben un estímulo doloroso neuropático y, a partir del día siguiente, 1 ml de analgésico i.p. diario durante una semana, transcurrida la cual son sacrificados. La manipulación de los animales se hará siguiendo las recomendaciones del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia, así como las propuestas por Zimmermann (1983) para la investigación sobre dolor experimental en animales conscientes. C) ANESTESIA Y PERFUSIÓN Los animales fueron sacrificados con una sobredosis i.p. de pentobarbital (120 mg/kg), comenzándose con las maniobras propias del proceso de perfusión una vez se comprobaba que el animal estaba profundamente anestesiado (ausencia de reflejo corneal), y con el corazón todavía latiendo. Todo el proceso de anestesia y perfusión en ningún caso sobrepasó los 15 minutos de duración, para evitar la indución iatrogénica de c-fos por efecto de la manipulación o de la propia anestesia (Herdegen y cols., 1991; Takayama y cols., 1994). La perfusión se inició en todos los casos con un lavado del árbol vascular con 100-200 ml de suero salino isotónico heparinizado (15.000 UI/litro), para, seguidamente introducir la solución fijadora formada por tampón fosfato y paraformaldehído al 4%. Finalizado el proceso de perfusión, los animales fueron decapitados, y se procedió al descalote y extracción del cerebro, así como de la porción lumbar de la médula espinal. D) OBTENCIÓN DE LOS CORTES Las piezas se conservan a 4ºC en la misma solución fijadora hasta el día siguiente. Transcurrido ese tiempo, se pasan a una solución crioprotectora con sacarosa al 30%, en la cual permanecen 24 horas. Una vez crioprotegidas, las piezas son congeladas y seccionadas con un criostato en cortes coronales de 40 ?m de grosor. E) REVELADO INMUNOCITOQUÍMICO DEL PROTO-ONCOGÉN C-FOS Tras tres lavados con PBS para eliminar la sacarosa, se procede a la detección inmunocitoquímica de la proteína codificada por el proto-oncogén objeto de nuestro estudio, c-fos, por el método del ABC (Hsu y cols., 1981). Los cortes pasan por sucesivas soluciones (Valverde-Navarro y cols., 1996). Montaje de los cortes: Los cortes se montan sobre portas gelatinizados con una solución de gelatina al 0,5% y alumbre de cromo al 0,05%. Se dejan secar durante toda la noche a temperatura ambiente, y al día siguiente, son deshidratados en diluciones crecientes de etanol (70º, 96º y 100º, Panreac), aclarados con xilol y cubiertos con Merckoglas. F) SELECCIÓN DE LOS NIVELES DE ESTUDIO Los niveles correspondientes tanto a la médula lumbar como al tronco de encéfalo son seleccionados con ayuda del atlas de Paxinos y Watson (2005). Se seleccionan al menos 2 cortes por cada uno de los niveles escogidos (Murphy y cols., 1995). G) OBTENCIÓN DE LOS PATRONES DE DISTRIBUCIÓN DE LAS NEURONAS FOS-POSITIVAS El patrón de distribución de las células inmurreactivas frente a Fos se obtienen a partir de dibujos en los que se puntean manualmente las neuronas Fos-positivas con ayuda de una cámara clara Zeiss acoplada a un microscopio Axioskopp de Zeiss con un objetivo de 20x. Dichos dibujos son elaborados por un experimentador desconocedor del grupo experimental al que pertenecen las preparaciones al puntearlas. H) OBTENCIÓN DE IMÁGENES DIGITALIZADAS DE LAS PREPARACIONES Las imágenes para el estudio fotográfico se capturan mediante una cámara de vídeo NIKON (Dxm 1200) acoplada un microscopio Nikon Eclipse e600 con luz directa. I) ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico de los datos se efectuará con ayuda del progama SPSS versión 15. El análisis se iniciará con una descriptiva que incluirá la media, el número de casos y la desviación típica para las variables originales. El análisis descriptivo se acompañará con una gráfica de las medias estimadas para cada variable original dentro de cada uno de los grupos experimentales. A continuación, se efectuará un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor para las variables, siendo el factor el diferente tratamiento que ha recibido cada uno de los grupos experimentales. En el caso de que el análisis detectase diferencias entre los grupos, tendría sentido realizar comparaciones múltiples para determinar conjuntos homogéneos de grupos experimentales que compartirían la misma media. Como es sabido, no existe una única técnica para llevar a cabo estas comparaciones, dependiendo el resultado final de la que hayamos empleado. En nuestro caso, si fuese preciso utilizaríamos los métodos de Tukey y Scheffé que producen situaciones extremas, particularmente este último que, siendo el más conservador, conduce siempre a un menor número de conjuntos homogéneos (Sokal y Rholf, 1995). RESULTADOS A nivel del asta posterior de la médula, la pregablina reduce el marcaje inducido por ambos estímulos dolorosos. La pregabalina induce la expresión de c-fos en ambos niveles rostrocaudales del núcleo del tracto solitario (NTS), con independencia de la aplicación o no de un estímulo doloroso. Al igual que en el NTS, la pregabalina induce la expresión de c-fos en ambos niveles de la porción lateral del núcleo parabraquial lateral (LPB), con independencia de la aplicación o no de un estímulo doloroso. En el locus coeruleus (LC) tanto la pregabalina, a nivel caudal, como el estímulo doloroso nociceptivo inducen la expresión de c-fos, no así el estímulo doloroso neuropático. Por el contrario, la pregabalina no provocó una intensa inmunorreacción frente a Fos en el núcleo dorsal del rafe (DR), pero sí redujo la expresión de c-fos inducida por el estímulo doloroso nociceptivo. CONCLUSIONES 1.- A nivel del asta posterior de la médula espinal, la pregabalina bloquea la expresión de c-fos inducida por un estímulo doloroso tanto somático superficial como neuropático. 2.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en el núcleo del tracto solitario, principalmente en los subnúcleos medial (m), central (ce) y ventral-lateral (vl). Por el contrario, dichas neuronas apenas se activan tras un estímulo doloroso, con independencia de que éste sea nociceptivo somático o neuropático. 3.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en la porción lateral del núcleo parabraquial, principalmente en los subnúcleos externo (elPB) y central (clPB). Asimismo, la aplicación de un estímulo tanto nociceptivo somático superficial como neuropático, también inducen, aunque en menor medida que la pregabalina, la activación de neuronas en el LPB, principalmente en el subnúcleo dorsal (dlPB) y en el área que queda por fuera del subnúcleo central (clPB). 4.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas especialmente en la porción caudal del locus coeruleus. El efecto sobre el LC de un estímulo algésico varía dependiendo de la naturaleza del estímulo: el nociceptivo somático superficial activa de forma importante sus neuronas, mientras que el neuropático no. 5.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en el núcleo dorsal del rafe, al igual que la aplicación de un estímulo doloroso nociceptivo somático superficial. Por el contrario la aplicación de un estímulo doloroso neuropático no logra la activación de neuronas en el LC.