Estudio del déficit de frataxina en Drosophila

Resumen

La ataxia de Friedreich (AF) es la ataxia hereditaria más común en la población de origen europeo, con una prevalencia de 2-4:100.000 (Palau y Espinós 2006). Se trata de una enfermedad neurodegenerativa que afecta principalmente al sistema nervioso central y periférico. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes presentan cardiomiopatía hipertrófica, que constituye la causa frecuente de muerte prematura. También pueden presentar intolerancia a carbohidratos y diabetes mellitus en un 20% y 10% de los casos respectivamente. Actualmente no se dispone de cura ni de tratamiento efectivo para la enfermedad, pero diversas estrategias terapéuticas se encuentran en proceso de investigación y ensayo clínico. La AF está causada por la expansión del triplete GAA en el primer intrón del gen FXN que produce una reducción importante de los niveles de la frataxina (Campuzano et al. 1996), cuya función se ejerce fundamentalmente en la mitocondria (Koutnikova et al. 1997). No obstante, no hay consenso en cuanto a la función exacta de esta proteína pero parece que está implicada en la homeostasis del hierro, en concreto en la formación de los grupos Fe-S (revisado en Pastore y Puccio 2013). De hecho, la falta de frataxina produce un déficit en la actividad de los enzimas que requieren un centro ferrosulfurado para su función. Otras características de la patología molecular de la AF incluyen la acumulación de hierro intramitocondrial acompañado de déficit de hierro en el citoplasma, disfunción mitocondrial y daño oxidativo (Babcock et al. 1997; Rötig et al. 1997; Puccio et al. 2001; Li et al. 2008). La frataxina es una proteína altamente conservada en la evolución, con ortólogos en todos los eucariotas y gran parte de los procariotas (Gibson et al. 1996; Adinolfi et al. 2002). El mutante de frataxina en levadura es viable, pero la ausencia de esta proteína en organismos superiores es letal (Rötig et al. 1997). Se han obtenido distintos modelos de AF en ratón basados en estrategias de “knockout” condicional donde la falta de frataxina está limitada a ciertos tejidos como el neural o el cardiaco (Puccio et al. 2001), la inserción de una expansión del triplete GAA en el gen endógeno Fxn (Miranda et al. 2002), o mediante la transgénesis de alelos mutados del gen humano FXN (Pook et al. 2001). También se dispone de diversos modelos celulares, incluyendo los desarrollados a partir de células de pacientes como linfoblastos y fibroblastos (Rötig et al. 1997). El ortólogo de FXN en Drosophila, fh (frataxin homolog) codifica para una proteína de 190 amino ácidos que muestra una elevada similitud con el resto de ortólogos de frataxina (Cañizares et al. 2000). Actualmente hay dos modelos de AF en Drosophila que recapitulan las características patológicas y bioquímicas de la enfermedad. Estos modelos fueron obtenidos mediante el sistema de RNA de interferencia (RNAi) para el silenciamiento de fh, combinado con el sistema UAS-GAL4 que permite el control espacio temporal de su expresión. En el primero de ellos, la expresión ubicua del transgen fhRNAi-1 produce una reducción del 90% de los niveles de frataxina que causa letalidad en el estado pre-adulto (Anderson et al. 2005). El segundo de los modelos de AF en la mosca induce una reducción del 70% en los niveles de frataxina cuando se expresa ubicuamente la construcción fhRNAi-2. Estos mutantes funcionales de falta de frataxina presentan una disminución de supervivencia y de capacidad locomotora, que se agravan en condiciones de elevado estrés oxidativo (hiperoxia), y a nivel bioquímico, una reducción de la actividad aconitasa (Llorens et al. 2007). Objetivos El objetivo principal de esta tesis es continuar la caracterización del modelo de AF en Drosophila obtenido en nuestro laboratorio, para contribuir al estudio de la función de frataxina y de la fisiopatología de la enfermedad, así como para la búsqueda de marcadores biológicos y estrategias terapéuticas. Para ello, definimos los siguientes objetivos específicos en esta tesis: (1) demostrar la equivalencia funcional entre las frataxinas humana y de Drosophila; (2) evaluar la validez del modelo de AF en Drosophila para el rastreo de fármacos, mediante el análisis del efecto de los compuestos deferiprona e idebenona; (3) identificar modificadores de los fenotipos inducidos por la falta de frataxina por medio de un rastreo de genes candidatos y (4) determinar el efecto de la falta de frataxina en la homeostasis de los metales. Metodología y resultados 1. Equivalencia funcional de las frataxinas humana y de Drosophila (Navarro et al. 2011, figuras 4 y 5) Para demostrar la equivalencia funcional de ambas proteínas, en este trabajo se evaluó si la proteína humana podía reemplazar funcionalmente a la frataxina endógena en Drosophila. Para ello se generó un transgen que contiene la región codificante de FXN bajo el control de la secuencia UAS. Después se obtuvieron moscas que portaban esta construcción UAS-FXN y también la construcción de RNA de interferencia UAS-fhRNAi-1, expresadas de forma ubicua con actina-GAL4. La expresión de FXN en la mosca revirtió la reducción de la actividad aconitasa observada en las larvas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-1 (Anderson et al. 2005), demostrando la equivalencia funcional de ambas proteínas. La sobrexpresión de la frataxina endógena en Drosophila produce una reducción en la actividad aconitasa junto con otros fenotipos patogénicos como reducción de la supervivencia o de la habilidad motora. De forma similar, la sobrexpresión de la frataxina humana reduce la actividad aconitasa de las larvas UAS-FXN. Se ha descrito que la frataxina de levadura puede formar oligomeros de distintos tamaños y que un aumento de la oligomerización sería la responsable de los déficits funcionales de las proteínas con centros Fe-S (Seguin et al. 2009). Por ello, consideramos la posibilidad de que la frataxina humana estuviera produciendo oligomeros o quizá formando algún tipo de agregados tóxicos que redujeran la cantidad de proteína funcional en Drosophila. Para comprobar esta hipótesis se realizó una cromatografía de filtración en gel. Mediante esta técnica se recuperó el total de la frataxina humana expresada en Drosophila en forma de monómero. La ausencia de oligomeros o agregados indica que el mecanismo de toxicidad de la sobrexpresión de frataxina es de otro tipo, posiblemente una saturación del sistema por exceso de proteína o quizá el secuestro de proteínas que interaccionen con frataxina. 2. La deferiprona y la idebenona rescatan fenotipos inducidos por la falta de frataxina en Drosophila (Soriano et al. 2013). Debido a la presencia de acúmulos de hierro en corazón, cerebro y otros tejidos de pacientes de AF (Bradley et al. 2000), se propuso la quelación de hierro como estrategia terapéutica para la enfermedad. El quelante de hierro deferiprona (DFP) produjo resultados prometedores en los primeros ensayos clínicos en pacientes en forma de reducción de la acumulación de hierro o mejoría de la ataxia (Boddaert et al. 2007; Kakhlon et al. 2008). Evaluamos el efecto de dos concentraciones de DFP (60 y 163 ?M) administradas o bien en el estadio de larva o bien a los individuos adultos, sobre los fenotipos de nuestro modelo en Drosophila de AF. Cuando la DFP se administró de forma temprana, se observó una mejoría de la supervivencia y la habilidad motora de las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2, siendo en general más efectiva la concentración más alta del compuesto. Dicha concentración de DFP también produjo la mejoría de la capacidad de escalada de los individuos neuralized-GAL4>UAS-fhRNAi-2, que presentan una reducción de los niveles de frataxina en el sistema nervioso periférico (Llorens et al. 2007). A continuación caracterizamos el efecto de la DFP sobre los niveles de hierro de las moscas modelo de AF. Encontramos que los niveles de hierro mitocondrial estaban aumentados en las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2, mientras que la forma ferrosa del hierro en la fracción soluble se encontraba disminuida. Esto puede ser indicativo de la existencia de agregados de hierro insolubles. En cuanto al efecto de la DFP, el quelante produjo un aumento de los niveles de hierro férrico y ferroso solubles, lo que sugiere que evita la formación de la forma insoluble tóxica. El aumento de los niveles de estrés oxidativo se ha descrito en pacientes de AF y en diversos modelos de la enfermedad (Rötig et al. 1997). Esto llevó a proponer el uso de antioxidantes como terapia que contrarrestara dicho daño oxidativo. La idebenona (IDE) es un antioxidante análogo a la coenzima Q10 que se utilizó en ensayos clínicos para la AF, en los que se describió una estabilización neurológica en pacientes pediátricos (Meier et al. 2012). Evaluamos también el efecto de la IDE sobre el fenotipo de las moscas modelo de AF, utilizando la misma estrategia que para la DFP, siendo en este caso las concentraciones de 7 y 15 ?M. Ambas concentraciones produjeron una mejora de la supervivencia y la capacidad de escalada tanto cuando el déficit de frataxina era ubicuo como cuando se restringió al sistema nervioso periférico. Como la actividad aconitasa es especialmente sensible al estrés oxidativo y se encuentra reducida en las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2 en hiperoxia (Llorens et al. 2007), utilizamos este fenotipo para evaluar el efecto antioxidante de la IDE y observamos que dicho compuesto pudo recuperar la actividad aconitasa hasta los niveles del control. Estos resultados de rescate de los fenotipos de AF en el modelo de Drosophila constituyen una validación para su uso en futuros rastreos de moléculas terapéuticas. 3. Rastreo genético de modificadores de fenotipos inducidos por falta de frataxina en Drosophila Una de las ventajas del uso de Drosophila como organismo modelo es la posibilidad de realizar rastreos genéticos a gran escala. Por este motivo, llevamos a cabo un rastreo de genes modificadores en nuestro modelo de AF en Drosophila. Seleccionamos 209 genes candidatos que incluían (1) rutas implicadas en la patogénesis de la enfermedad como la homeostasis de los metales, el estrés oxidativo y la autofagia; (2) proteínas que se encontraron diferencialmente expresadas en las moscas con déficit de frataxina en un estudio de proteómica realizado en el laboratorio y (3) modificadores obtenidos mediante rastreos genéticos en modelos en Drosophila de otras enfermedades neurodegenerativas. La línea fhRNAi-2 / fhRNAi-2 ; actin-GAL4 / TM6B , tub-GAL80 se cruzó con una serie de líneas disponibles comercialmente con mutaciones funcionales por RNAi (Vienna Drosophila Resource Center), falta de función y sobrexpresión (Bloomington Stock Center, Indiana University) de los genes elegidos. Los descendientes de estos cruces, de genotipo adecuado, fueron evaluados respecto a su capacidad de escalada en búsqueda de alelos modificadores que mejoraran o empeoraran dicho fenotipo. Entre los modificadores identificados se encontraron diversos genes que participan en la ruta de TOR (Target of Rapamycin) y en la homeostasis de metales y por tanto, seleccionamos estas dos rutas para un estudio más detallado de su participación en la patogénesis de la AF. 3.1. La ruta de TOR interacciona genéticamente con frataxina (Calap-Quintana et al. 2015, figura 1) La ruta de TORC1 (Target of Rapamycin Complex 1) sirve como reguladora central del metabolismo celular, crecimiento, proliferación y supervivencia e integra señales intracelulares y extracelulares sobre la disponibilidad de nutrientes. La mayoría de estas señales se integran mediante el complejo TSC1/TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex 1/2) que inhibe a Rheb (Rhas homolog enriched in brain ortholog) y este a su vez activa a TORC1. La síntesis proteica es promovida por la activación del factor de transcripción eIF-4E (eukaryotic translation initiation factor 4E) y de la kinasa S6K por medio de TORC1. Entre los modificadores del rastreo genético llevado a cabo en el modelo de AF en Drosophila, cuatro pertenecían a la ruta de TORC1: Tsc1, S6K, eIF-4E y Lrrk (Leucine-rich repeat kinase), activador de eIF-4E. En conjunto, se observó que la inhibición de la ruta de TORC1 producía una mejora del fenotipo motor del modelo de AF en mosca, señalando la implicación de esta ruta en la patogénesis de la enfermedad. Además, estos resultados sugieren una posible estrategia terapéutica para la AF mediante la inhibición de la ruta de TORC1, por ejemplo con compuestos como la rapamicina. 3.2. Rutas implicadas en la homeóstasis de los metales interaccionan genéticamente con frataxina (Soriano et al., enviado para su publicación). Debido a la participación del hierro en la fisiopatología de la AF, se incluyeron genes implicados en la homeostasis de los metales en la lista de candidatos para el rastreo genético. En este trabajo, para aumentar la confianza de los modificadores identificados, se incluyó un segundo fenotipo además de la capacidad de escalada. En concreto, se evaluó la mejoría o empeoramiento del defecto observado en el ojo de las moscas GMR-GAL4>UAS-fhRNAi-1. En concreto, en estos individuos la falta de frataxina se ha dirigido al ojo en desarrollo lo que produce un fenotipo de ojo “rugoso” que se puede observar externamente. Mediante esta estrategia se identificaron genes modificadores que participan en la homeostasis del hierro, transportadores de cobre y zinc así como en la detoxificación producida por metales. Al reducir la expresión de las proteínas reguladoras de hierro Irp-1A e Irp-1B y de los transportadores de hierro regulados por ellas, transferrinas 1 y 2 y malvolio, mejoraron los fenotipos de ojo y de capacidad de escalada. También mejoraron ambos fenotipos al reducir los niveles de seis transportadores de zinc así como de la chaperona de cobre (Atox1) y del transportador de cobre (dCutC). La sobrexpresión de MTF-1, un factor de transcripción que regula la detoxificación de los metales, también rescataba los fenotipos de ojo y escalada. Sin embargo las metalotioneínas, que son activadas por MTF-1 actuaron como supresores cuando se reducía su expresión. Al haberse identificado genes modificadores de los fenotipos inducidos por falta de frataxina implicados en el transporte y la regulación de la homeóstasis de los metales, se procedió a estudiar esta ruta más en detalle. 4. Acumulación de metales en el modelo de AF en Drosophila (Soriano et al., enviado para su publicación). En muestras procedentes de pacientes de AF, se caracterizó una redistribución del hierro, cobre y zinc que no iba acompañada de un aumento de los niveles totales de estos metales. Sin embargo en el modelo de AF en Drosophila sí que observamos la acumulación de hierro, zinc, cobre y manganeso. Además, el quelante de zinc TPEN así como los quelantes de cobre TTM y BSC mejoraron la capacidad de escalada de las moscas actina-GAL4>UAS-fhRNAi-2. Para estudiar el mecanismo por el cual los modificadores identificados en el rastreo genético producían la supresión de los fenotipos de las moscas con deficiencia de frataxina, estudiamos su efecto en la acumulación de hierro. Observamos que esta se reducía en el caso de malvolio, las transferrinas e Irp1 pero también para dos de los transportadores de zinc, ZnT41F y fear of intimacy (foi) y para la sobrexpresión de MTF-1. Aunque las metalotioneinas se suelen asociar a la detoxificación de los metales y del daño oxidativo que producen éstos, también se las ha asociado con un efecto prooxidante (Suzuki et al. 1996). Los niveles de estrés oxidativo se encuentran incrementados en las moscas modelo de la AF. La reducción genética de la metalotioneína MtnA, al igual que la sobrexpresión de MTF-1,además de mejorar la capacidad de escalada, rescataron los niveles de estrés oxidativo. Este resultado apoya la hipótesis del efecto prooxidante de las metalotioneínas. Y en conjunto, hemos identificado que la homeostasis de los metales está implicada en la patogénesis de la AF, y que la quelación del zinc y el cobre tiene potencial terapéutico para la enfermedad. Conclusiones 1. La expresión del gen humano FXN rescata el déficit de actividad aconitasa producido por la falta de la frataxina endógena en Drosophila, indicando la equivalencia funcional de ambas proteínas. 2. El quelante de hierro deferiprona mejora los fenotipos inducidos por la falta de frataxina (supervivencia y habilidad motora) en el modelo de AF en Drosophila por medio de la quelación de la acumulación de hierro mitocondrial. 3. El antioxidante idebenona mejora los fenotipos inducidos por la falta de frataxina en el modelo de AF en Drosophila y rescata la reducción de la actividad aconitasa en hiperoxia. 4. Los niveles de zinc, cobre, manganeso y aluminio se encuentran aumentados en el modelo de AF en Drosophila y la quelación de zinc y cobre mejoran el fenotipo motor inducido por la falta de frataxina. 5. La reducción en la expresión de genes implicados en el transporte del hierro, cobre y zinc y la sobrexpresión del factor de transcripción MTF-1 mejoran los fenotipos (desarrollo del ojo externo y habilidad motora) del modelo de AF en Drosophila. 6. Los miembros de la ruta de TORC1 TSC1, S6K, Lrrk y eIF-4E interaccionan genéticamente con frataxina de tal forma que la inhibición genética de dicha ruta suprime el déficit en la capacidad de escalada que muestran las moscas modelo de AF. Bibliografía Adinolfi S, Trifuoggi M, Politou AS, Martin S, Pastore A. 2002. A structural approach to understanding the iron-binding properties of phylogenetically different frataxins. Hum. Mol. Genet. 11:1865–1877. Anderson PR, Kirby K, Hilliker AJ, Phillips JP. 2005. RNAi-mediated suppression of the mitochondrial iron chaperone, frataxin, in Drosophila. Hum. Mol. Genet. 14:3397–3405. Babcock M, de Silva D, Oaks R, Davis-Kaplan S, Jiralerspong S, Montermini L, Pandolfo M, Kaplan J. 1997. Regulation of mitochondrial iron accumulation by Yfh1p, a putative homolog of frataxin. Science 276:1709–1712. Boddaert N, Le Quan Sang KH, Rötig A, Leroy-Willig A, Gallet S, Brunelle F, Sidi D, Thalabard J-C, Munnich A, Cabantchik ZI. 2007. 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