Development Of An Oxidative Cytomic Panel Of High-Content Miniaturized Assays for Detection of In Vitro Cytotoxicity and Prediction of Acute Toxicity of Drugs and Xenobiotics

Resumen

La predicción de la toxicidad de xenobióticos (cosméticos, productos químicos y medicamentos ) en seres humanos es esencial en la evaluación de riesgos y la Toxicología reguladora. En la actualidad, las nuevas directrices europeas instan a probar estrategias novedosas para evaluar y validar la seguridad de los medicamentos, productos químicos y cosméticos. Consideraciones éticas y económicas exigen métodos in vitro validados como una alternativa al uso de animales para la detección y predicción de toxicidad humana de acuerdo con el principio de las 3Rs (reemplazo, reducción y refinamiento). Para aumentar la capacidad de predicción de la toxicidad aguda en humanos mediante la cuantificación in vitro de ensayos funcionales, nos hemos planteado validar un grupo de ensayos citómicos miniaturizados para la detección de estrés oxidativo en tres líneas celulares de origen humano: hepatoma (HepG2), neuroblastoma (SH-SY5Y) y adenocarcinoma de riñón (A-704). Se han seleccionado 60 compuestos (Tabla 2), que incluyen fármacos y productos químicos, para los cuales se ha documentado la toxicidad aguda in vivo (LD50 o LC50 en sangre), con datos evaluados por el proyecto europeo ACuteTox y depositados en la base de datos Acutoxbase (Sjöström et al., 2008), además de su citotoxicidad basal in vitro, determinada por el ensayo de captación de Rojo Neutro en células 3T3, validado por ICCVAM/ECVAM. Dentro del conjunto de tóxicos seleccionados para nuestro estudio se incluyen, por una parte, compuestos en los que los ensayos de citotoxicidad humana basal predicen la toxicidad humana aguda y compuestos que no se localizan sobre la recta de regresión en la correlación in vitro/in vivo (“outliers”). Las determinaciones de citotoxicidad por CMF incluyen la cuantificación de la actividad peroxidativa, de los niveles intracelulares de anión superóxido y de óxido nítrico y las determinaciones por HCA de los niveles de la base modificada 8-oxo como indicadores de lesión oxidativa al DNA. Posteriormente se utilizó una línea celular con capacidad metabólica (HepaRG) y se comparó los resultados obtenidos con los valores de citotoxicidad basal de HepG2. Finalmente se determinó la presencia de transportadores de fármacos en la membrana plasmática de las cuatro líneas celulares por citometría de flujo y qPCR además de verificar su funcionalidad mediante ensayos de eflujo de sustratos fluorescentes. El objetivo principal del estudio es mejorar el valor predictivo de la citoxicidad basal como alternativa in vitro a los animales de laboratorio, mediante la puesta a punto de procedimientos miniaturizados de cultivo celular y la incorporación de parámetros más específicos, indicadores de dianas moleculares. Esto se abordará mediante la investigación de las alteraciones celulares tempranas inducidas por compuestos tóxicos, aplicando una plataforma de ensayos de toxicidad de alto contenido, el conjunto de ensayos denominados "Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo”. Los objetivos concretos son: 1 – Miniaturizar y optimizar un Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo basado en la citometría de flujo para el análisis in vitro en células humanas susceptible de ser adaptado a la robotización y al análisis bioinformático de los resultados. 2 – Evaluar la capacidad predictiva de toxicidad humana aguda in vivo del Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo mediante su aplicación a una serie de compuestos en los que la correlación entre toxicidad in vivo e in vitro previamente investigada en estudios multicéntricos. 3 – Validar el Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo mediante la correlación de los valores de citotoxicidad obtenidos en los ensayos de estrés oxidativo con los obtenidos en ensayos in vitro de referencia. 4 – Determinar la capacidad del Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo para clasificar correctamente los compuestos usando el sistema GHS adaptado a los datos de humano. 5 – Determinar la capacidad de estos ensayos para predecir la toxicidad órgano-específica. 6 – Aplicar el Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo al análisis cuantitativo in vitro de la citotoxicidad basal y la toxicidad dependiente de biotransformación de diferentes xenobióticos. 7 – Determinar mediante citometría de flujo, PCR cuantitativa y ensayos funcionales la expresión de transportadores multifármaco en las líneas utilizadas.