Autentificación de cepas de la CECT mediante MALDI-TOF MS y GC FAME

Resum

Las colecciones de cultivo microbianas son organizaciones, generalmente oficiales, cuya principal misión es conservar a largo plazo cepas de microorganismos, y suministrarlas, previa petición, a laboratorios, empresas y centros que requieran microorganismos para investigación, controles de calidad, docencia o para numerosas aplicaciones biotecnológicas. Además, las colecciones de cultivo, para ser consideradas como tal, deben cumplir ciertas normas relacionadas con la recolección, la autentificación, el mantenimiento y la distribución de los cultivos de microorganismos, así como la catalogación y los sistemas de información Una de las tareas más importantes en una colección pública es que el material conservado sea lo más similar posible al material original depositado. Sin embargo, pueden ocurrir cambios en la cepa debido a errores humanos (p. ej. un etiquetado cruzado) o contaminaciones accidentales. En estos casos hay una sustitución o alteración real del material biológico que puede ser muy evidente si el cambio es burdo pero no tanto cuando la cepa que desplaza a la original es muy cercana en términos filogenéticos. Además hay que considerar también los cambios por deriva genética. Especialmente en microorganismos la detección de estos últimos puede suponer un reto por los tiempos cortos de generación que presentan y por su alta tasa de mutación, lo que da lugar a la formación de cultivos heterogéneos. La diversificación ocurre a nivel genético y epigenético durante el crecimiento tras repetidos subcultivos y es más problemática cuando afecta a las propiedades que motivaron su depósito. Para asegurar al máximo la fidelidad de los cultivos respecto al material recibido para depósito en una Colección de Cultivos, las cepas deben ser preservadas con el menor número posible de pases. Además, con el fin de garantizar o al menos sustentar que las cepas depositadas no se desvían del material original, de forma rutinaria se procede a la autentificación de las cepas. La autentificación consiste en la verificación de la identidad de un microorganismo conocido, estudiando características morfológicas, genéticas, bioquímicas y/o fisiológicas conocidas. Existen distintas metodologías utilizadas para la autentificación de cepas microbianas, pero su aplicabilidad dependerá de su poder de resolución, reproducibilidad, facilidad de manejo y coste reducido. En la presente Tesis Doctoral se analiza la adecuación de la técnica de análisis de perfiles proteicos obtenidos mediante MALDI-TOF MS y de la técnica de análisis de los ésteres metilados de los ácidos grasos de membrana por cromatografía de gases (GC FAME) mediante el sistema (MIDI) como técnicas de autentificación de cepas procariotas. Para ello, se seleccionaron cepas de referencia de diferentes géneros depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Se analizó el perfil proteico de las cepas de referencia seleccionadas mediante MALDI-TOF MS, siguiendo el protocolo de extracción etanol/ácido fórmico recomendado por Bruker Daltonics (http://www.bdal.de), obteniendo los espectros mediante un espectrómetro de masas Reflex IV (Bruker Daltonics) y realizando el análisis de datos con el programa BioTyper 1.1 (Bruker Daltonics). Y se determinó la composición en ésteres metilados de ácidos grasos (FAME) de las cepas de referencia seleccionadas en condiciones de cultivo definidas (medio, temperatura y tiempo de incubación), mediante Cromatografía de Gases (GC) con la unidad cromatográfica Agilent 6850 y aplicando los protocolos estándar descritos por MIDI, Microbial Identification System. Análisis de los perfiles con el sistema comercial Sherlock Microbial Identification System (MIS, Microbial ID Inc. (MIDI), Newark, DE, USA).