Propagación in vitro y estudio con marcadores cromosómicos de Limonium perplexum L. Sáez & Rosselló

Resumen

Las técnicas de cultivo in vitro han resultado muy útiles para la protección de la flora amenazada. Limonium perplexum L. Sáez y Rosselló se ha catalogado como una especie endémica y amenazada "en peligro crítico" atendiendo a la Lista Roja de la Flora Vascular y Amenazada y siguiendo los criterios de la UICN (Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza). En el primer bloque de este trabajo, se ha llevado a cabo un protocolo de propagación in vitro para la planta objeto de estudio, con sus respectivas fases de multiplicación de brotes y enraizamiento, y su posterior aclimatación de la planta a las condiciones de cámara de crecimiento e invernadero. El siguiente apartado consiste en la determinación, análisis e interpretación de la estabilidad genética o variación somaclonal que pueden tener lugar durante la propagación in vitro. Las técnicas moleculares son metodologías sensibles para evaluar tanto la estabilidad como la inestabilidad genética de plantas regeneradas a partir de cultivo in vitro (Shuangxia J. et al. 2008; Saker M.M. et al. 2000; Bouman et al. 2001). Actualmente, existen varios trabajos que indican que el uso de marcadores moleculares permite caracterizar con precisión la aparición de la variación somaclonal (Polanco C y Ruiz M.L, 2002). Con el interés de evaluar la generación de variación somaclonal se realiza un estudio con marcadores moleculares inter-microsatélite (ISSR). El análisis se realiza con 148 ejemplares obtenidos de cultivo in vitro que han sido mantenidos mediante sucesivos subcultivos durante 12 meses. En la última etapa del estudio se lleva a cabo un análisis citogenético en poblaciones naturales de Limonium perplexum y con los ejemplares obtenidos del cultivo in vitro tras 12 meses. Para la realización del estudio se utiliza la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) que se basa en la utilización de una sonda de ADN para detectar un gen o una secuencia de nucleótidos específicos en cromosomas mitóticos, meióticos o en núcleos. Se han utilizado como sondas, familias multigénicas de ADN ribosomales. Los ADNs ribosómicos se encuentran constituyendo dos familias multigénicas distintas, la familia multigénica 45S y la familia 5S. La familia 45S está compuesta por los genes de ADN ribosomal 18S, 5.8S y 26/28S, dos espaciadores internos que se transcriben (ITS-1 e ITS-2), y un espaciador intergénico (IGS) que incluye en ambos extremos dos espaciadores externos (ITS-1 y ITS-2). Esta sería la subunidad básica de 45S que junto con el otro gen nuclear ribosomal 5S producen los ARN maduros que forman parte de la subunidades que dan lugar a los ribosomas citoplasmáticos en la mayoría de los eucariotas. Los genes ribosomales son considerados como buenos marcadores para la hibridación in situ ya que han conservado secuencias de ADN que se encuentran en un número alto de copias (Datson y Murray 2003). En este trabajo se realizan los cariotipos e idiogramas antes del establecimiento del cultivo in vitro y después de 12 meses de cultivo in vitro y se interpretan las similitudes y posibles diferencias entre ambos.