Heterogeneity of Human Melanoma Cell Linesa quantitative study of protein and mRNA expression profiles using Flow Cytometry and Real time PCR

Resumen

El melanoma es el tipo de cáncer de piel más agresivo. Ocurre en los melanocitos, células productoras de melanina ubicadas en la capa inferior de la epidermis, en la piel. El melanoma puede propagarse a través del tejido creciendo en áreas cercanas. Cuando las células tumorales se separan del tumor primario y viajan a través del sistema linfático o de la sangre para otras partes del cuerpo donde se establecen y empiezan a formar un tumor metastásico, se denomina metástasis. La metástasis generalizada es la principal causa de muerte en el melanoma. Los cánceres surgen a través de la adquisición de mutaciones que suprimen la senescencia y promueven la división celular, pero hay distintos modelos para explicar el crecimiento del tumor. El modelo clonal o estocástico afirma que se producen cambios (epi)genéticos en todas las células tumorales al largo del tiempo, y que hay una selección natural gradual de las células más aptas y más agresivas. El modelo de las células madre tumorales sugiere que sólo una subpoblación de células dentro del tumor, las células madre tumorales, o en el caso del melanoma, las células iniciadores del melanoma, tienen la capacidad de regenerarse y mantener un tumor in vivo. La mayor parte de la población de células tumorales es heterogénea, no comparte estas propiedades y carece de la capacidad de ser tumorigénicos. Un proceso importante para la progresión del melanoma y la ocurrencia de metástasis es la transición epitelio-mesenquica. Este proceso se caracteriza por la pérdida de adhesión celular, la represión en la expresión de E-cadherina resultando en el aumento de la movilidad celular. En el melanoma la metastasis ocurre preferencialmente hacia el cerebro, pulmón, hígado y piel. Esta selectividad de la metástasis por determinados órganos viene determinada por consideraciones anatómicas de flujo sanguíneo, por propiedades intrínsecas de las células tumorales y por propiedades intrínsecas del órgano diana. La interacción quimiocina-receptor puede inducir señales que no solo actúen sobre la movilidad celular hacia un gradiente, sino que las quimiocinas pueden jugar papeles alternativos sobre la adhesión de las células tumorales, la invasión, la supervivencia, el crecimiento tumoral y la angiogénesis. El melanoma es un tumor heterogéneo a nivel genético, morfológico y antigénico. Las líneas celulares muestran células con distinta morfología incluyendo formas ovales pequeñas, fusiformes, poligonales planas y grandes con formas dendríticas. La expresión antigénica es también muy heterogénea, pudiendo distinguirse subpoblaciones celulares de distinto tamaño con distintos marcadores antigénicos. Esta expresión puede ser dinámica, variando con la superficie de cultivo celular, cambios de medio, densidad celular y duración del cultivo. Otro modelo comúnmente usado en el estudio del melanoma es un modelo animal de xenotransplante. En este modelo, muestras humanas de melanoma (provenientes de pacientes o de líneas celulares) son transplantadas en ratones atímicos inmunodeficientes que, al tener un sistema inmunitário defectuoso, permiten el crecimiento de las células tumorales y la expresión de sus propiedades. El melanoma cutáneo humano es una neoplasia altamente heterogénea compuesta por subpoblaciones de células tumorales con fenotipos moleculares y biológicos distintos. Estas distintas subpoblaciones son la base de una complejidad biológica que incluye los fenómenos de auto-renovación, diferenciación, iniciación tumoral, progresión y resistencia a terapia. En este trabajo se plantean las siguientes hipótesis: La utilización de líneas celulares de melanoma humano permitie determinar la heterogeneidad intra- e inter-tumoral mediante la cuantificación de las proteínas que intervienen en los procesos anteriormente mencionados utilizando técnicas cuantitativas de citometría de flujo y PCR-cuantitativa en líneas celulares procedentes del tumor primario o de la metástasis. El xenotransplante de las líneas celulares a ratones atímicos inmunodeficientes permite establecer las subpoblaciones celulares y variaciones de expresión génica que se seleccionen preferentemente en los tumores, cuando estos se desarrollan en ratones dentro de un microambiente más similar al que existía en el paciente afectado. En este marco, se proponen los siguientes objetivos: - Caracterizar fenotípica y funcionalmente, mediante análisis citómico y cuantificación de la expresión génica, los antígenos de melanoma, marcadores de células madre tumorales, de pluripotencia y del proceso de transición epitelio mesenquina, en distintas líneas celulares de melanoma humano, obtenidas a partir de melanomas primarios y de metástasis. - Caracterizar fenotípica y funcionalmente, mediante análisis citómico y cuantificación de la expresión génica, los sistemas formados por los receptores de quimiocinas CXCR3, CXCR4, CXCR7, CCR7 y CCR10 y respectivas quimiocinas ligando, en distintas líneas celulares de melanoma humano, obtenidas a partir de melanomas primarios y de metástasis. - Comprender las variaciones fenotípicas y de expresión génica que se seleccionan preferentemente en los tumores, cuando estos se desarrollan en ratones sobre la presión del microambiente. - Correlacionar los resultados obtenidos con el origen del melanoma, primario o metástasis. Metodología 1. Muestras biológicas - Líneas celulares de melanoma humano: MeWo, A-375, SK-MEL-2, SK-MEL-28, Malme-3M (ATCC); WM-266, WM-115 (ECACC); Mel-HO, Mel-Juso, IPC-298, IGR37, IGR39 (DSMZ) y Mel-RC08 (Departamento de Patologíaa, Universitad de Valencia). WM-115 , Mel-HO, Mel-Juso, IPC-298 y IGR39 son líneas establecidas a partir de tumores primarios mientras que MeWo, A-375, SK-MEL-2, SK-MEL-28, Malme-3M, WM-266, IGR37 y Mel-RC08 son líneas establecidas a partir de tumores primarios. - Xenotransplantes (de WM-115 y WM-266) y sus líneas derivadas. 2. Cuantificación de proteínas por citometria de flujo: - Caracterización inmunofenotipica por citometría de flujo de antígenos de melanoma, marcadores de células madre tumorales, característicos de la transición epitelio-mesenquima y de quimiocinas y sus receptores (Tabla 2A y 2B). - Análisis de la side population. 3. Cuantificación de la expresión génica, por PCR cuantitativa: - Aislamiento y control de calidad del ARN aislado de las líneas celulares. - Cuantificación de los distintos genes listados (Tabla 5). 4. Análisis estadístico: - El análisis estadístico de las cuantificaciones de proteína por citometría de flujo se hijo con test t de student. - Los datos de expresión génica se refieren a ?Cts y se presentan en heatmaps producidos con el programa R (package Heatmap3). - La correlación entre los datos de cuantificación de proteína y de expresión génica se realizaron con Graphpad prism usando la correlación de Spearman. Resultados Se han caracterizado 13 líneas de melanoma humano, 5 con origen primario y 8 con origen en metástasis de distintas localizaciones (piel, cerebro, nódulos linfáticos y pulmón). Hemos encontrado un perfil de expresión de antígenos de melanoma, marcadores de células madre tumorales, característicos de la transición epitelio-mesénquima y de quimiocinas muy heterogéneo. Además, analizando el perfil de todos los genes cuantificados es percetible que no hay un patrón especifico de expresión génica que caracterice y distinga las células primarias de las metastáticas. Al revés, se puede apreciar la variabilidad y heterogeneidad que existe entre las distintas líneas estudiadas. Con relación al sistema quimiocinas-receptor, comprobamos que la expresión de receptores es intracelular y no ocurre en la superficie de las células. Verificamos también que los niveles de expresión de los receptores de quimiocinas y sus ligandos sufren variaciones dinámicas tras la xenotransplantacion, que son distintas dependiendo del origen de la línea trasplantada. Sin embargo, no se ha detectad la expresión de superficie de los receptores de quimiocinas, como esperado. Analizando colectivamente los datos relativos al xenotransplante (i.e., WM115 vs WM115-CX-SC and WM115-CX-IM), se pueden apreciar importantes cambios a nivel de proteína y de expresión génica. La subpoblación ABCB1+ ha incrementado en ambas las líneas y con relación a la SP se produjo un aumento em ambas las lineas, más significativo en WM-115-CX-IM (Table 20). Este se puede deber a un gran aumento en la expresión génica de ABCG2. Además, la línea parental no tenía una subpoblación CD90+ que apareció en las dos líneas transplantadas. De igual forma se produjo un aumento de la expresión génica de CD117 y CD133 (Table 21, Figure 27). También se produjeron aumentos en la expresión de genes de pluripotencia y característicos de la transición epitélio-mesenquima (en concreto de algunas moléculas de adhesión). Los patrones de expresión génica fueron distintos dependiendo del local de inoculación de las células en el ratón (subcutáneo o intramuscular). Conclusiones - Las técnicas cuantitativas de citometría de flujo y de PCR en tiempo real permitieron caracterizar el perfil de expresión de distintos marcadores, a nivel proteico y genético, en distintas líneas celulares de melanoma humano, obtenidas a partir de melanomas primarios y de metástasis, reflejando la heterogeneidad del melanoma humano. - Los marcadores estudiados no se correlacionan con el origen del tumor (primario o metastasis). - La presión selectiva de microambiente del ratón produce importantes cambios en los patrones de expresión génica y de proteína, que son distintos dependiendo del local de inoculación de las células en el ratón (subcutáneo o intramuscular).