Efecto del entrenamiento físico sobre los factores endoteliales en el sistema arterial de conejo

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las primeras causas de mortalidad en la población occidental y prácticamente el 50% se podrían prevenir con modificaciones del estilo de vida. En este sentido, la práctica regular de ejercicio físico se asocia con una reducción de entre un 20 a un 40% de la incidencia de eventos vasculares primarios y secundarios y del riesgo de muerte por enfermedad cardiovascular. Parte de estos beneficios estarían relacionados con los efectos directos y repetitivos que produce el ejercicio físico sobre la pared vascular, induciendo adaptaciones tanto funcionales como estructurales. Durante el ejercicio hay un aumento significativo del volumen minuto cardiaco, así como una redistribución del gasto cardíaco con un aumento del flujo sanguíneo hacia el músculo esquelético activo, a expensas de una reducción del flujo a los órganos poco activos o inactivos. Estos cambios se atribuyen a variaciones del tono vascular. El tono vascular está regulado por la influencia simultánea de sustancias vasoactivas intravasculares (hormonas y derivados plaquetarios) neurotransmisores (sistema nervioso autónomo perivascular) y la producción de sustancias vasoactivas liberadas por el endotelio. Estudios previos han demostrado que el entrenamiento puede disminuir la actividad simpática tanto en animales como en humanos. Tanto la respuesta al estímulo adrenérgico como la contracción a la noradrenalina se ven disminuidas en el entrenamiento. Esto se traduce en una disminución del tono simpático y a un aumento de la vasodilatación. Las adaptaciones vasculares al entrenamiento se producen por los episodios reiterados de aumento del shear stress, que es la tensión tangencial ejercida sobre el endotelio como resultado del aumento del flujo sanguíneo inducido por el ejercicio, o por la exposición a sustancias humorales como la acetilcolina (Ach). Son tres los mecanismos vasodilatadores de origen endotelial que pueden verse involucrados en el proceso: la prostaciclina (PGI2), procedente del metabolismo del ácido araquidónico, el óxido nítrico (NO) que se sintetiza a partir de la L-arginina, por estimulación de la óxido nítrico sintasa (NOS), y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), de estructura desconocida, pero que está estrechamente relacionado con los canales de potasio, principalmente los dependientes del calcio. El predominio de uno u otro mecanismo depende del lecho vascular, de la especie y varía a lo largo del árbol vascular. Además, se han descrito mecanismos de compensación entre ellos cuando se altera el funcionamiento de alguna de las vías. A largo plazo el entrenamiento puede producir una remodelación vascular, aumentando el diámetro de los vasos existentes, modificando la estructura de las diferentes capas del músculo liso vascular o mediante la formación de nuevos vasos capilares a partir de uno ya existente, cambios mediados por el aumento de la liberación de factores de crecimiento vascular endotelial. Estos cambios pueden enmascarar las adaptaciones endoteliales. En base a estos antecedentes, planteamos la hipótesis de que el entrenamiento físico puede mejorar la función endotelial por aumento de los factores relajantes derivados del endotelio. Por consiguiente, el objetivo general del presente trabajo se centró en el estudio de los efectos del ejercicio físico sobre la respuesta vascular y la función endotelial con especial hincapié en la participación de los factores relajantes derivados del endotelio. Para ello hemos caracterizado la respuesta al nitroprusiato sódico, que produce relajación del músculo liso vascular independiente del endotelio, a la acetilcolina, para estudiar la relajación dependiente de endotelio, en ausencia y en presencia de inhibidores de los factores endoteliales, y la respuesta contráctil al cloruro de potasio (KCl), a la endotelina (ET-1) y la respuesta adrenérgica tanto a la noradrenalina (NE) como al estímulo eléctrico (EE). Por último, determinamos los niveles plasmáticos de L-arginina, precursor de la síntesis de NO, de nitratos y nitritos (NOx) como indicadores de la producción de NO, y de NG,NG-dimetil-L-arginina (ADMA), un inhibidor endógeno de la NOS endotelial. Este estudio se realizó comparativamente en conejos entrenados y no entrenados. Debido a la heterogeneidad de las células endoteliales, que implican diferencias en la expresión de receptores, estos mecanismos pueden diferir según el territorio vascular. Por consiguiente el estudio lo hemos desarrollado en tres lechos distintos, en la arteria carótida, como representativa de la circulación cerebral, en la arteria renal, como representante de un lecho en el cual el flujo sanguíneo no aumenta e incluso disminuye durante el ejercicio, y en la arteria femoral, como ejemplo de un vaso de conducción que irriga áreas musculares activas durante el ejercicio. Para la realización de este estudio se han utilizado muestras de conejos macho White New Zealand que fueron divididos en dos grupos. Uno permaneció estabulado durante todo el periodo de entrenamiento mientras que el otro grupo se sometió a un protocolo de entrenamiento físico que consistió en una sesión de entrenamiento diaria, 5 días a la semana durante un total de 6 semanas. Cada sesión de entrenamiento se divide en seis períodos de carrera continua durante 4 minutos con 1 minuto de descanso entre ellos, a una velocidad de 0.33 m/s. Una vez finalizado el periodo de entrenamiento y previo al sacrificio, a cada conejo se le extrajo sangre de la vena marginal de la oreja, para la determinación plasmática de NOx por colorimetría según el método de Griess y de L-arginina y de ADMA mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Tras el sacrificio se extrajeron muestras del sóleo para la determinación de la actividad de la enzima citrato sintasa (CS) por el método de Srere. La actividad de la CS es un marcador de la actividad mitocondrial y se utiliza para valorar la eficiencia del entrenamiento. Asimismo, se tomaron las muestras vasculares, que, una vez limpias, se cortaron en segmentos de 3 mm de longitud para su montaje en un baño de órganos termostatado y carbogenado para el estudio de la reactividad vascular. La actividad de la CS fue un 26% superior en los conejos entrenados, lo cual indica que el protocolo de entrenamiento fue efectivo. En cuanto a la respuesta relajante, el entrenamiento no modificó la respuesta al nitroprusiato sódico en ninguno de los tres lechos vasculares estudiados, lo cual indica que el entrenamiento físico no produjo cambios en la capacidad relajante del músculo liso vascular. La relajación a la acetilcolina en la arteria carótida fue significativamente menor en el grupo de conejos entrenados. Esta menor relajación podría ser debida a que el entrenamiento altere los factores endoteliales. Puesto que la relajación no se modifica en presencia de indometacina, un inhibidor de la COX, no parece haya participación de prostanoides en este lecho vascular. En presencia de L-NAME, un inhibidor exógeno de la NOS, la respuesta relajante a la acetilcolina disminuye tanto en conejos entrenados como en no entrenados, indicando que parte de la respuesta es debida a la liberación de NO. Sin embargo la inhibición es mayor en el grupo no entrenado, por lo cual el entrenamiento disminuye la liberación de NO inducida por acetilcolina. Esta menor liberación de NO podría ser debida a que la modalidad de entrenamiento empleada induzca un incremento del estrés oxidativo debido a un aumento en la producción de radicales libres que conlleve a una menor biodisponibilidad de óxido nítrico. Para valorar la producción de estrés oxidativo inducido por el ejercicio, se realizaron curvas de Ach en ausencia y en presencia de superóxido dismutasa (SOD). La SOD cataliza la reacción del anión superóxido (O2-) en peróxido de hidrogeno (H2O2). Puesto que la SOD no modifica la respuesta a la Ach, no parece que las diferencias de relajación sean debidas a un aumento de radicales libres. Debido a que el NO puede explicar solo en parte la relajación dependiente de endotelio en este vaso, se estudió la respuesta al bloqueo los canales de potasio con KCl, para evaluar si la relajación remanente podía ser explicada por un mecanismo EDHF. El bloqueo con KCl es efectivo, indicando que parte de la relajación es debida a la participación de canales de K+, pero sin diferencias entre grupos. Para evaluar si los canales responsables son los activados por calcio, se incubó con charibdotoxina y apamina, cuya respuesta bloqueante no fue diferente a la producida por el L-NAME, por lo que no hay participación de estos canales en la arteria carótida, y el mecanismo EDHF es en parte atribuible a canales de potasio distintos a los activados por calcio. Finalmente, la relajación remanente se bloquea con ouabaína poniendo de manifiesto la participación de la bomba Na+-K+-ATPasa en la relajación dependiente de endotelio como mecanismo EDHF. En la arteria renal, el ejercicio físico no modifica la respuesta relajante a la Ach. En ambos grupos la respuesta se debe a la participación del NO y de canales de K+. Tanto la relajación mediada por NO como la mediada por canales de K+ es similar en controles y en entrenados. Además, no parece que intervengan los canales de K+ dependientes del Ca+ sensibles a la charibdotoxina y a la apamina. En este lecho la relajación remanente también es bloqueada por la ouabaína. En la arteria femoral, el ejercicio físico tampoco modifica la respuesta relajante a la Ach y tampoco hay participación de los prostanoides en la respuesta relajante dependiente de endotelio. Sin embargo, al igual que en la arteria carótida, la inhibición con L-NAME es menor en el entrenado indicando la menor participación del NO en este grupo. La incubación con charibdotoxina mas apamina produce un mayor bloqueo de la relajación en el grupo de conejos entrenados. En este caso, el aumento compensatorio de la liberación de EDHF cuando la biodisponibilidad de NO está reducida, contribuye al mantenimiento de la vasodilatación dependiente de endotelio. La respuesta contráctil inespecífica se estudió mediante curvas de KCl, cuyo mecanismo de contracción es independiente de receptor e involucra la entrada de calcio a la célula a través de canales de calcio voltaje-dependientes. En la arteria carótida, el entrenamiento disminuyó la sensibilidad al KCl. Esta disminución puede atribuirse a cambios en la estructura de la pared vascular para preservar el flujo sanguíneo cerebral durante el ejercicio. En las arterias renal y femoral, la respuesta contráctil al KCl no se modificó con el entrenamiento. La valoración de la respuesta específica, dependiente de receptor, la hemos estudiado sobre la respuesta adrenérgica por ser uno de los factores que mayor influencia tienen en el mantenimiento del tono vascular. La noradrenalina produce contracción dependiente de la concentración por activación de receptores ?1 en las tres arterias estudiadas. El entrenamiento no modifica la respuesta a la noradrenalina en ninguno de los lechos vasculares estudiados. La contracción inducida por el estímulo eléctrico, que está mediada por la liberación de noradrenalina de las terminaciones nerviosas perivasculares, tampoco se modifica con el entrenamiento. Para valorar los efectos sobre receptores no adrenérgicos, se estudió la respuesta a la endotelina, un potente vasoconstrictor cuyos efectos están mediados por la participación de receptores ETa. El entrenamiento tampoco no modifica la respuesta a la endotelina en ninguno de los lechos vasculares estudiados Finalmente, el entrenamiento no modifica los niveles plasmáticos de L-arginina, de nitratos y nitritos, ni de ADMA. Conclusiones: En la arteria carótida, el ejercicio físico crónico disminuye la relajación a la acetilcolina por disminuir la biodisponibilidad de NO. Este efecto se compensa probablemente con cambios estructurales en el músculo liso que disminuyen su capacidad contráctil. En la arteria renal, el ejercicio físico crónico no modifica la respuesta relajante a la acetilcolina ni al nitroprusiato sódico; tampoco afecta a la respuesta contráctil adrenérgica, ni al KCl ni a la endotelina. Por lo tanto, el entrenamiento no parece que afecte al tono vascular ni a la biodisponibilidad del NO en este lecho vascular preservando así la hemodinámica renal y la homeostasia. En la arteria femoral el ejercicio físico crónico disminuye la biodisponibilidad de NO inducida por acetilcolina que se compensa con un aumento de relajación mediada por canales de K+ activados por Ca2+, compatible con una compensación por aumento de EDHF. El ejercicio físico crónico no modifica los niveles plasmáticos de L-arginina, ni de ADMA ni de NOx.