Role of the NF-kB pathway and nitric oxide in mammary gland involution after weaning. Implications in breast cancer

Resum

INTRODUCCIÓN La glándula mamaria es un órgano dinámico que alcanza su máximo desarrollo funcional con la lactancia, momento en el cual, a través de la producción de leche, aporta nutrientes y protección inmunológica a las crías de los mamíferos. Cuando la lactancia finaliza con el destete, el exceso de tejido glandular debe desaparecer y la glándula sufre una extensa remodelación hasta alcanzar nuevamente un estado pre-gestacional, preparada para un nuevo ciclo. La involución del tejido mamario es un proceso complejo durante el cual se suceden de forma coordinada una serie de eventos como la muerte de las células epiteliales secretoras, la proliferación de tejido adiposo circundante y la remodelación de la estructura glandular. El proceso involutivo puede clasificarse en dos etapas, siendo la primera un proceso reversible en el que predomina la apoptosis, y la segunda fase un fenómeno irreversible, en el que se da la remodelación del epitelio ductal y en el que participan proteasas como las metaloproteasas (MMPs) y las catepsinas. Cabe señalar que las vías de señalización que coordinan este proceso también están implicadas en el desarrollo de cáncer de mama. Es más, si bien desde una perspectiva epidemiológica, el embarazo y la lactancia protegen del desarrollo de neoplasias mamarias a largo plazo, se ha demostrado que los principales mecanismos que controlan la involución también controlan procesos de carcinogénesis. Las cuatro vías principales de señalización que regulan la involución post-lactancia son STAT5/STAT3, NF-?B, TGF-? y PI3K/AKT. Los factores de transcripción STAT3 y NF-?B regulan la expresión de genes de respuesta inflamatoria. Nuestro grupo ha demostrado en trabajos previos que uno de los genes inducidos por NF-?B es la Óxido Nítrico Sintasa Inducible (NOS2). Este enzima es responsable del aumento de los niveles de óxido nítrico (NO) en la glándula mamaria durante el destete. OBJETIVOS: Los objetivos de el presente trabajo son: i) estudiar el papel del NO en la regulación de dos de las principales vías del proceso involutivo, STAT3 y NF-?B; ii) estudiar la existencia de modificaciones postraduccionales inducidas por el NO en proteínas, centrándonos en la nitración de resíduos de tirosina. Posteriormente se trata de esclarecer el efecto de estas modificaciones postraduccionales; iii) estudiar qué mecanismos fisiológicos regulados por NO durante el destete también son activados en células de cáncer de mama que son expuestas a altas concentraciones de NO. RESULTADOS: Para estudiar el papel del NO en la involución de la glándula mamaria tras la lactancia utilizamos ratones knockout (KO) para el gen NOS2 (NOS2-KO). Si bien no se apreciaron diferencias entre los ratones NOS2-KO y los wild-type (WT) durante el embarazo se objetivó que los ratones KO tenían una mayor producción de leche y sus crías una mayor ganancia ponderal durante la lactancia. A su vez, existía un retraso evidente en el inicio de la involución en estos ratones con respecto a los WT. Los animales NOS2-KO presentaban un aumento en la fosforilación de STAT5 durante el destete, con un aumento de los niveles de expresión de ?-caseina con respecto al tejido glandular de los WT. Ambos parámetros son características distintivas del período de lactancia. A su vez, si bien en ambos tipos de ratones se objetivó una activación de STAT3, que alcanzó su pico a las 24h tras el destete, esta activación estaba claramente reducida en los ratones NOS2-KO. De hecho, se vio tanto una activación de STAT3 y NF-?B como un aumento de la apoptosis en el tejido glandular de los ratones WT tras el destete; sin embargo, durante el mismo periodo de tiempo, se observó una menor apoptosis (medida como actividad de caspasa 3) así como un retraso en la activación de NF-?B en los ratones KO, en comparación con los WT. Estos resultados sugieren que el NO tiene un papel en la regulación del proceso involutivo post-lactancia, dado que, en ausencia de NOS2, la activación de las cascadas de señalización que rigen la involución se encuentra retrasada, lo cual dilata el inicio de la fase de apoptosis y consecuentemente, de la fase de remodelación tisular. Por otra parte, NO actúa como una especie reactiva e induce modificaciones nitrosativas en lípidos y proteínas, que pueden conllevar activación o inhibición de actividad enzimática. En proteínas estas modificaciones suelen ser s-nitrosilación de tioles de cisteína y nitración de residuos tirosina. Realizamos estudios de nitroproteómica en homogenados de glándula mamaria de rata lactante y tras 72h de destete en los que se demostró un aumento del patrón de nitración durante el destete. Objetivamos que la catepsina D (CD) se nitra durante el destete y que esta modificación postraduccional suponía un aumento en su actividad del 50% en estudios in vitro. El papel de la nitración en la actividad de la CD se confirmó en estudios in vivo mediante los cuales objetivamos que no había diferencias en el procesamiento de la proteasa, pero su actividad proteolítica se encontraba significativamente reducida durante el destete en los ratones KO. Finalmente, mediante un estudio de espectrometría de masas, se determinó que uno de los residuos tirosina nitrados se encontraba en la posición 168 de la cadena pesada. Finalmente, realizamos estudios preliminares para intentar dilucidar qué vías de señalización reguladas por NO durante el destete también se veían afectadas en células de carcinoma de mama. Para ello se utilizó un modelo in vitro de células MCF-7 tratadas con altas concentraciones de SIN-1, un donante de NO. De acuerdo con la literatura, la exposición a concentraciones crecientes de NO inducía disminución de la viabilidad celular, sin embargo, también se objetivó la activación de vías de señalización pro-supervivencia. Concretamente comprobamos que a concentraciones mayores de NO existía un aumento de los niveles de AKT fosforilado y un descenso en I?B?, un inhibidor de NF-?B, el cual se acompañaba de un aumento en los niveles de mRNA de MMP-9, una diana transcripcional de NF-?B. Estos datos preliminares apuntan a la posibilidad de que en células de cáncer de mama, tras estímulo con NO, se activen las mismas vías reguladas por esta molécula durante la involución post-lactancia. CONCLUSIONES: La ausencia de NOS2 implica una disminución en los niveles de NO durante la involución de la glándula mamaria tras el destete, lo cual retrasa pero no impide este proceso fisiológico. Las diferencias más importantes objetivadas han sido a nivel de la activación de las vías STAT3 y NF-?B, lo cual retrasa el inicio de la primera fase del proceso, en la cual la apoptosis predomina. Este retraso también tiene un impacto en la segunda fase de la involución en la que se da la remodelación de la matriz extracelular. Además, el NO induce modificaciones postraduccionales específicas que modulan la función enzimática, por ejemplo la nitración de residuos de tirosina. En este trabajo describimos la nitración de CD que induce su activación. En un modelo de cáncer de mama luminal, la exposición a altas dosis de NO parece inducir señales contradictorias dado que por una parte reduce la viabilidad celular y por otra, active vías anti-apoptóticas como AKT y NF-?B, lo que apunta al papel importante de esta molécula en la regulación de múltiples procesos celulares.