Valor de la citometría de flujo Multiparamétrica en una estrategia basada en la toxicología in vitro para la predicción de Riesgo y clasificación de compuestos químicos

Resumen

La entrada en vigor de las Normativas REACH (PARLAMENTO EUROPEO 2006) y CLP (PARLAMENTO EUROPEO 2008) fomentó que la Unión Europea financiara diferentes programas marco para desarrollar estrategias in vitro para evaluar la seguridad de los productos químicos y reducir el número de animales y el coste económico. Nuestro estudio desarrolla una estrategia citómica in vitro utilizando la citometría de flujo (CMF) (Herrera et al. 2007) para la predicción de riesgo y clasificación de 57 compuestos químicos.El objetivo último de esta tesis es el de proporcionar métodos citómicos, como alternativa in vitro al animal de laboratorio para mejorar el valor predictivo de los ensayos de citotoxicidad basal y dependiente de biotransformación mediante la puesta a punto de procedimientos miniaturizados de cultivo celular. 1. Optimizar una plataforma de ensayos citómicos de alto contenido basada en CMF para el análisis in vitro en células de origen humano, susceptible de ser adaptado a robotización y al análisis bioinformático de los resultados. 2. Aplicar la plataforma del ensayo citómico al análisis cuantitativo in vitro de la citotoxicidad de diferentes xenobióticos. 3. Validar el ensayo citómico mediante la correlación de los valores obtenidos de citotoxicidad con los valores de citotoxicidad de referencia en ensayos in vitro de toxicidad basal. 4. Evaluar la capacidad predictiva de toxicidad humana aguda in vivo del ensayo citómico in vitro mediante su aplicación a una serie de compuestos en los que la correlación entre la toxicidad in vivo e in vitro ha sido previamente investigada en estudios multicéntricos. 5. Disminuir el número de compuestos mal clasificados por la correlación entre sus valores de toxicidad in vivo e in vitro. 6. Evaluar el valor de los resultados citómicos para clasificar los compuestos analizados según los criterios de la normativa CLP.METODOLOGIA: Líneas celulares: Se usarán las líneas celulares establecidas humanas A.704 (adenocarcinoma renal humano), SH-SY5Y (neuroblastoma humano) y HepG2 (hepatoma humano). Compuestos químicos de estudio: Se analizarán un total de 57 sustancias químicas de referencia que son una representación de todas las categorías de toxicidad según el reglamento del GHS, para las cuales está documentada la toxicidad tanto in vitro (Sjöström et al. 2008)) como in vivo (Sjöström et al. 2008) (Hoffmann et al. 2010). Una parte de estos compuestos no logran predecir la toxicidad humana aguda mediante ensayos de citotoxicidad. Cuando se correlacionan los datos in vitro e in vivo publicados estos compuestos quedan fuera de la recta de regresión (compuestos outliers). Desarrollo de los ensayos citómicos miniaturizados de citotoxicidad en líneas celulares: Los cultivos celulares se cultivarán durante 24 horas en placas de 96 pocillos, a los que se adicionarán los compuestos a ensayar durante 24 a 48 horas, según la línea celular. Se realizarán dos paneles de ensayos diferentes, uno para determinar la concentración inhibitoria al 50% (panel citotóxico) y el segundo para determinar la concentración efectiva al 50% (panel citómico). El análisis citómico se realizará mediante CMF y cada panel constará de los siguientes ensayos: Panel citotóxico: -Ensayo de entrada de yoduro de propidio (Coder et al. 2001). -Ensayo de entrada de rojo neutro (Clothier et al. 2008). Panel citómico: -Ensayo de niveles de calcio intracelular. -Ensayo del potencial de membrana plasmática. - Ensayo del potencial de membrana mitocondrial. En cada uno de los ensayos se medirá la dispersión frontal y lateral de la luz láser, indicador del tamaño y complejidad celular respectivamente y un estimador de la viabilidad. Valoración de la capacidad predictiva de los ensayos citómicos in vitro para predecir la toxicidad aguda en humano y la capacidad para clasificar los compuestos según las clases del reglamento GHS. Para estimar la capacidad predictiva de los ensayos citómicos se calcularán los coeficiente de correlación de Pearson y el ajuste de la curva por regresión lineal. Se correlacionarán los valores de LC50 en sangre determinados en casos de envenenamientos en humano (Sjöström et al. 2008) con: - Los valores de IC50 in vitro con el test de captación de Rojo Neutro (NRU) por la línea celular 3T3, fibroblastos murinos (Sjöström et al. 2008). - Los valores LD50 in vivo de rata y ratón (Hoffmann et al. 2010). - Los valores de IC50 y de EC50 de los paneles citómicos. La valoración de la capacidad de los ensayos citómicos para clasificar los compuestos según las clases de toxicidad que estipula el reglamento GHS se realizará mediante los programas bioinformáticos “Cluster” y “Treeview” y mediante el análisis de las curvas ROC (Receiver Operating Characteristics).