Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae

Resumen

RESUM El creixement polaritzat és un fenomen que ocorre pràcticament en totes les cèl.lules, des de procariots fins a organismes pluricel.lulars sent fonamental per a nombrosos processos cel.lulars incloent la proliferació, diferenciació i morfogènesi. En S. cerevisiae tots els aspectes del creixement polaritzat deriven del citoesquelet d´actina. Atès que el gen ROT1 és un gen essencial de Saccharomyces cerevisiae amb funció desconeguda que es va identificar en un rastreig genètic on es buscaven mutacions supressores de la letalitat de la soca mutant tor2ts . TOR2 està implicat en el control del creixement cellular i en l´organització del citoesquelet d´actina i com que ROT1 suprimeix a la mutació tor2, podria ser que ROT1 estiguera relacionat amb aquestes funcions. Els resultats obtesos indiquen que la inactivació de ROT1 origina un defecte en la progressió del cicle cel.lular amb l´acumulació de cèl.lules en les últimes etapes de divisió cel.lular i l´aparició de cèl.lules regemmades que no finalitzen correctament la divisió cel.lular per un defecte en la septació. Hem averiguat que Rot1 està implicat en el funcionament del citoesquelt d´actina. Encara que no és necessari per al procés de gemmació, Rot1 és essencial per al manteniment del creixement apical en la gemma i per a la repolarització del citoesquelet d´actina al coll entre la cèl.lula mare i filla al final de la mitosi. La supressió del mutant cdc42 per la sobreexpressió de ROT1 i la letalitat sintètica entre la mutació rot1 i mutacions en la ruta d´integritat cel.lular (ruta PKC) reforcen la connexió entre Rot1 i el citoesquelet d´actina. Les funcions del citoesquelet d´actina afectades en el mutant rot1 i el fet que la inactivació de ROT1 suprimeix el defecte d´hiperpolarització del mutant clb2 però no la hiperpolarització de cèl.lules que sobreexpressen CLN2, indica que Rot1 afecta exclusivament els processos del citosquelet d´actina regulats per Clb2 i no per Cln2. Les dades genètiques i fenotípiques obteses reflecten un antagonisme funcional entre Rot1 i Clb2 en el control del citoesquelt d´actina al llarg del cicle cel.lular. Les cèl.lules rot1 són hipersensibles a la sobreexpressió de Clb2 mentre que la seua letalitat se suprimeix per la deleció clb2. A més a més, les mutacions rot1 i clb2 originen efectes contraris en la funció del citoesquelt d´actina, de fet, aquests efectes es compensen en les cèl.lules doble mutant clb2 rot1. Rot1 controla específicament l´estabilitat de la ciclina Clb2, ja que en les cèl.lules mutants rot1 sactiva la ruta MEN i la fosfatasa Cdc14. De fet, la inactivació de ROT1 en cèl.lules que estan degradant activament Clb2 origina l´estabilització de la ciclina. Interaccions sintètiques de ROT1 amb gens implicats en el proteasoma, APC o SCF, i el fet que Rot1 participe en la degradació de Cln2 i substrats de les rutes de degradació de la regla de l´N-terminal i UFD suggereixen una funció més general de Rot1 en degradació de proteïnes. Hem obtés que Rot1 és una proteïna integral de membrana localitzada en la membrana del reticle endoplasmàtic/embolcall nuclear amb orientació luminal modificada per N-glicosilació en les Asn 103, 107 i 139. Analitzant possibles dominis funcionals en la proteïna hem demostrat que l´extrem C-terminal (aminoàcids 229-256) és necessari per a l´ancoratge de la proteïna a la membrana i a més té un paper essencial per a la seua funció. L´extrem N-terminal (aminoàcids 1-25) és essencial per la funcionalitat de Rot1 però no és necessari per a la translocació. La proteïna s´inserta en el reticle endoplasmàtic a través del translocó Sec61 per un mecanisme posttraducional independent de SRP i dependent del complex Sec62/Sec63. __________________________________________________________________________________________________