Mecanismos de control de estrés oxidativo en Escherichia colidesarrollo de ensayos citómicos bacterianos basados en cepas modificadas genéticamente

Abstract

El estrés oxidativo se produce cuando hay un desequilibrio entre los niveles de pro-oxidantes y la capacidad antioxidante celular. En E.coli la respuesta frente al estrés oxidativo está regulada principalmente por 2 regulones, OxyR y SoxRS. La citometría de flujo es una técnica que permite el análisis de la funcionalidad celular utilizando para ello sondas fluorescentes. En el trabajo realizado en esta Tesis se ha puesto a punto ensayos citómicos utilizando cepas bacterianas que son permeables a las diferentes sondas fluorescentes. En primer lugar se comparó la permeabilidad de 2 cepas E.coli B y E.coli K12, encontrándose que la cepa de E.coli B por la composición de LPS de la membrana externa era más permeable a las sondas fluorescentes que E.coli K12, para ello se llevaron a cabo ensayos de tinción con diferentes sondas fluorescentes como Fluoresceína isotiocianato (FITC, detección proteica ), Rojo Nilo ( detección lipídica ), DiBAC( detección del potencial de membrana plasmático ), Yoduro de propidio ( muerte celular) Dihidrodiclorofluoresceína y dihidroetidina ( nivel de peróxido y de superóxido respectivamente) ,Naranja de mercurio ( HgOr) para detectar los niveles de glutatión y MitoSox (nivel mitocondrial de superóxido) . Los niveles de tinción de FITC, Rojo Nilo, DiBAC, PI fue similar encontrándose un aumento en los niveles de tinción de los fluorocromos Dihidrodiclorofluoresceína (DHDC-DA) y Dihidroetidina (DHE), concluyendo que la cepa de E.coli B sería una cepa de elección en los ensayos citómicos. Se utilizó la cepa de E.coli B en el estudio de estrés oxidativo empleando para ello mutantes en los genes oxyR, sodAB, y gshA, genes implicados en la respuesta antioxidante. Las sondas fluorescentes empleadas para la detección de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno son sondas no fluorescentes y al oxidarse específicamente con un determinado radical libre se oxidan y emiten fluorescencia detectable con un citómetro de flujo. La especificidad de las sondas fluorescentes es la siguiente: DHDCF-DA específica para la detección de niveles de peróxidos; DHE es específica para la detección de niveles de superóxido; Dihidrorodamina 123 (DHR123) es específica para los niveles de peróxidos, OH. y peroxinitrito; Diaminofluoresceína (DAF) es específica para detectar los niveles de óxido nítrico; HgOr es específica para detectar los niveles de glutatión. En este estudio se encontraron diferencias entre los niveles de radicales libres en las cepas salvajes y las mutantes cuando se sometían a diferentes agentes pro-oxidantes generadores de ROS o especies reactivas de nitrógeno (RNS) como H2O2, tert-butilhidroperóxido (generadores de peróxidos) plumbagina, menadiona, paraquat (generadores de superóxido) y espermina NO y DEANO (dadores de óxido nítrico), la muerte celular se determinó con PI. Concluyendo que se dispone de ensayos bacterianos sensibles para la detección de estrés oxidativo. La aplicación de estos ensayos bacterianos se determinó con diferentes compuestos como el catecol y compuestos relacionados en su estructura química como el 3-metilcatecol, hidroquinona y 3-metilhidroquinona. Para este estudio se utilizó la cepa salvaje y la cepa mutante en el gen oxyR y se ensayaron los niveles intracelulares de superóxido con la sonda fluorescente DHE. Los resultados mostraron que los metil-derivados del catecol y de la hidroquinona presentaban un nivel alto de superóxido y estos niveles de superóxido fueron mayores en la cepa mutante que en la cepa salvaje. Otra aplicación de estos ensayos citómicos fue la detección de estrés oxidativo en MDMA, droga conocida como éxtasis. El MDMA se metaboliza en HHMA precursor del compuesto neurotóxico 5-NAC-HHMA. Se ha observado en estudios realizados con ratones que el compuesto MDMA es un compuesto quiral y que el enantiómero R(-) MDMA es más neurotóxico que el enantiómero S(+). En nuestro estudio colaboramos con un grupo de investigación que sintetizó el enantiomero R (-) HHMA y lo comparamos con un compuesto no purificado R(+-) HHMA así como diferentes metabolitos de la detoxificación del MDMA como el MMMA, amino alcohol y la dopamina como compuesto relacionado estructuralmente. Se determinó por citometría de flujo los niveles de superóxido de los compuestos utilizando para ello una la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano. Los resultados fueron un nivel similar de superóxido entre los enantiómeros y los demás compuestos ensayados, pero cuando se determinó la muerte celular utilizando PI se observó una mayor citotoxicidad en los enantiómeros y en la dopamina que en los metabolitos MMMA y amino alcohol, concluyéndose los dos enantiómeros presentaban una citotoxicidad similar. Los ensayos citómicos bacterianos se utilizaron para detectar la toxicidad y la generación de ROS del compuesto tideglusib y moléculas relacionadas para el desarrollo de nuevas compuestos en el estudio del Alzheimer. Estas moléculas candidatas fueron seleccionadas por una compañía farmacéutica, el tideglusib y las moléculas candidatas son inhibidores irreversibles de la enzima GSK3 implicada en la enfermedad de Alzheimer. Se utilizaron 3 cepas de E.coli B: wild-type, oxyR-, sodAB-. Los resultados indicaron que había compuestos en los que se detectaba alto nivel de superóxido y otros compuestos que producían muerte celular, permitiendo una clasificación de dichos compuestos en citotóxicos o inductores de estrés oxidativo. Como conclusión los diferentes ensayos citómicos bacterianos desarrollados en esta Tesis han servido para: 1. Estudiar los mecanismos de acción de las enzimas implicadas en las defensas antioxidantes de E.coli. 2 Desarrollar diferentes ensayos que han permitido caracterizar compuestos como catecol y sus derivados, MDMA y sus derivados desde el punto de visto toxicológico y también como posibles generadores de ROS. 3 Caracterizar distintas moléculas candidatos de importancia en el desarrollo de nuevos fármacos en campos tan importantes como la enfermedad de Alzheimer.