Dextranos de bacterias lácticas aisladas de productos cárnicoscaracterización y aplicaciones

Resumen

Algunas bacterias del ácido láctico (BAL) sintetizan exopolisacáridos (EPS) que mejoran las propiedades reológicas de alimentos fermentados, lo que despierta su interés industrial. Además, algunos de ellos han demostrado poseer propiedades beneficiosas para la salud (antitumorales, inmunomoduladoras, hipocolesterolémicas o prebióticas) y, por tanto, son buenos candidatos para la elaboración de alimentos funcionales. Entre los EPS, los dextranos son sintetizados por especies de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Streptococcus y Weisella de forma constitutiva o inducible. Sin embargo, poco se conoce sobre la regulación de la expresión de los genes dsr, que codifican las proteínas que los sintetizan, las dextransacarasas. El presente trabajo de tesis doctoral se ha centrado en la caracterización a nivel molecular, fisiológico, metabólico y fisicoquímico de los EPS producidos por Lactobacillus sakei MN1 (EPS-LS) y Leuconostoc mesenteroides RTF10 (EPS-LM), dos BAL aisladas de productos cárnicos. También ha contemplado el estudio de la funcionalidad biológica de dichos polímeros, como agentes antivirales e inmunoestimulantes y el análisis del potencial de Lb. sakei MN1 como probiótico frente a patógenos de peces. En primer lugar, se ha determinado que ambas cepas, en presencia de sacarosa como fuente de carbono, producen homopolisacáridos tipo dextrano con enlaces ?-(1-6) en su cadena principal y un 3 % (EPS-LS) o un 9 % (EPS-LM) de ramificaciones con enlaces ?-(1-3). Dichos polisacáridos se encuentran asociados a la pared celular o rodeando a las células, según se ha observado por microscopía electrónica. Como resultado del estudio genético, se ha demostrado que los determinantes genéticos responsables de la producción del EPS-LS y el EPS-LM, se encuentran localizados en los plásmidos denominados pMN1 (13,7 kpb) y pRTF10 (20,6 kpb), respectivamente. Además, la determinación de la secuencia completa de nucleótidos de pMN1 (11.126 pb) ha revelado que pertenece a una familia de plásmidos que replican por el mecanismo de tipo theta, cuyo prototipo es pUCL287, y que contiene un replicón (el origen de replicación y los genes repA y repB), el gen dsrLS y 7 marcos de lectura abierta. También, se ha estudiado la expresión del gen dsrLS a nivel transcripcional y los resultados obtenidos indican que la dextransacarasa DsrLS se sintetiza a partir de dos transcritos: uno monocistrónico y otro policistrónico, que incluye los genes repA, repB y dsrLS. Además, se ha comprobado que la expresión de ambos mRNAs no se ve incrementada en presencia de sacarosa en el medio de cultivo. Por tanto, esta hexosa no es un agente inductor de la expresión de DsrLS siendo este el primer caso descrito de expresión sincronizada de una dextransacarasa y de la maquinara replicativa de un plásmido. El análisis bioinformático del producto de dsrLS ha revelado que codifica un péptido de 1.767 aminoácidos con una masa molecular de 190.039 Da y que contiene un péptido líder en su extremo amino terminal, lo que indica que DsrLS debe ser una proteína extracelular. Los modelos de la estructura 3D de DsrLS, basados en homología de aminoácidos y de conformación estructural, indican que es un enzima dimérico cuyo sustrato es la sacarosa y que posee actividad dextransacarasa. Cultivos de Lb. sakei MN1 y Lc. mesenteroides RTF10 crecidos en medio definido han sido utilizados para la producción de EPS-LS y EPS-LM, respectivamente. Los polímeros han sido purificados a partir de los sobrenadantes de los cultivos por precipitación con etanol, dialisis y fraccionamiento cromatográfico con una recuperación de los mismos del 80 % y con un grado de pureza del 99 %. Ambos EPS han mostrado actividad antiviral in vitro frente a la infección por dos virus de salmónidos: el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI) y el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI). Además, se ha comprobado que el EPS-LS in vivo posee actividad antiviral y actúa como un agente estimulante de la respuesta inmune de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss). Por otro lado, Lb. sakei MN1 ha mostrado in vitro la capacidad de agregarse y formar biopelículas cuando crece en presencia de glucosa (no produce dextrano), pero no en presencia de sacarosa, cuando el dextrano es sintetizado por la bacteria. Este comportamiento ha sido validado in vivo utilizando un modelo de larvas gnotobióticas de pez cebra (Danio rerio). Además, este modelo ha permitido demostrar que Lb. sakei MN1 colonizada el intestino de las larvas y es capaz de competir con el patógeno de peces Vibrio anguillarum. Por todo lo expuesto, tanto Lb. sakei MN1 por su potencial probiótico, como el EPS-LS que produce, por su acción inmunomoduladora y antiviral, resultan muy prometedores para su aplicación en el desarrollo de piensos funcionales para salmónidos.