Compuestos fenólicos de phagnalon rupestre activos en hipersensibilidad y liberación de mediadores inflamatorios

Résumé

En el presente trabajo se aborda primeramente el estudio de la modulación farmacológica de la hipersensibilidad retardada, por dos inhibidores de proteinquinasa C (palmitoilcarnitina y trifluoperazina) en dos modelos distintos, uno de contacto inducido por 2,4-dinitro-1-fluorobenceno y otro de tipo tuberculínico inducido por eritrocitos de cordero. Esta parte dio lugar a la publicación del artículo nº 1, On the activity of trifluoperazine and palmitoylcarnitine in mice: delayed hypersensitivity models en Life Sciences 66: 183-188 (2000). Tras la selección de dos de los modelos ensayados, se procedió a la evaluación de la actividad en los mismos de varias especies de la familia de las Compuestas. A la vista de los resultados se procedió a la realización de un estudio fitoquímico de la especie Phagnalon rupestre guiado por bioensayo. De éste y tras el empleo de diversas técnicas cromatográficas y análisis espectroscópicos, se aislaron e identificaron de los extractos acetoetílico y butanólico, catorce compuestos fenólicos, seis de los cuales son descritos por nuestro grupo por primera vez en la naturaleza: cuatro prenilhidroquinonas, 2-(3¿,3¿-dimetilalil)hidreoquinona-1-O-ß-glucopiranósido y sus derivados 4¿-hidroxilo, 4¿¿-cafeilo y 2¿,3¿-dihidro-3¿-hidroxilo; un lignano, 7,7¿-bis-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)-8,8¿-dihidroximetil-tetrahidrofuran-4-O-ß-glucopiranósido y una acetofenona 9ß,12-dihidroxitremetona-12-O-ß-glucopiranósido; y los ocho restantes son conocidos: tres flavonoides, luteolina7-O-glucósido, apigenina 7-O-glucósido y luteolina 7-O-glucurónido; la acetofenona piceína; y los ácidos 3,5- y 4,5-dicafeilquínicos, así como los ésteres metílicos de ambos ácidos. Se demostró la actividad antiinflamatoria y antialérgica de Phagnalon rupestre en hipersensibilidad por contacto inducida por dinitrofluorobenceno y determinado como principios responsables de dicha actividad el glucósido de luteolina, las hidroquinonas 4¿-hidroxiprenilada y cafeilada, y los derivados ácido 3,5-dicafeilquínico y éster metílico del ácido 4,5-dicafeilquínico. Estos trabajos se detallan en los artículos nº 2, New prenylhydroquinone glucosides from Phagnalon rupestre en Journal of Natural Products 64: 1111-1113 (2001), nº 3 Phagnalon rupestre as a source of compounds active on contact hypersensitivity en Plata Medica (2002, en prensa) y nº 4 phenolic glycosides from Phagnalon rupestre en Phytochemistry 59: 857-860 (2002). Posteriormente se evaluó la actividad antioxidante y antiradicalaria de siete compuestos fenólicos en modelos de peroxidación lipídica, tanto enzimática como no enzimática, captación de la especie radicalaria 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, así como en la producción de radical superóxido en el sistema hipoxantina/xantina oxidasa. El estudio de la acción de los dos conjugados dicafeil-metilquinatos sobre la enzima xantina oxidasa, nos permitió determinar un potente efecto inhibidor de tipo competitivo y reversible para el éster metílico del ácido 4,5-dicafeilquínico. Este trabajo, Phenolic methylquinates from Phagnalon rupestre are competitive inhibitors of xanthine oxidase and impair lipid peroxidation, ha sido enviado a Free Radical Research. Finalmente, los mismos compuestos fenólicos fueron ensayados en distintos modelos evaluando diversos parámetros relacionados con la función neutrofílica. Así se estudiaron los siguientes factores: liberación de elastasa, actividad mieloperoxidasa y la producción de leucotrieno B4 y radical superóxido. Se observó que los conjugados dicafeilquínicos redujeron la actividad mieloperoxidasa, inhibieron la liberación de elastasa y de superóxido, resultando la cafeil-hidroquinona inactiva en esta última faceta. Se puede afirmar que la conjugación del ácido cafeico, tanto de la glucosil-hidroquinona como del ácido quínico, es importante para la inhibición de la formación de leucotrieno B4, lo cual otroga a estos compuestos valor como potenciales agentes antiinflamatorios. Este trabajo ha dado lugar al artículo nº 6, Effects of caffeoyl conjugates of isoprenyl-hydroquinone glucoside and quinic acid on leukocyte function en Life Sciences (2002, en prensa). __________________________________________________________________________________________________ SUMARY In the first part, the effect of pre- and post-challenge treatments with trifluoperazine and palmitoylcarnitine, two protein kinase C inhibitors, on the inflammation caused by delayed hyperensitivity to dinitrofluorobenzene (DNFB) and sheep red blood cells (SRBC) in mice is reported. The ability of trifluoperazine in inhibiting cutaneous DTH reaction, depending on the treatment schedule and the hapten challenge dose, has been determined. Analysis of the methanolic extract of the aerial parts of Phagnalon rupestre (Asteraceae) had led to the isolation of fourteen phenolic compounds. Six have been identified on the basis of their NMR spectra as new natural compounds: four prenylhydroquinone glucosides 1-O-ß-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3¿,3¿-dimethylallyl)-benzene, 1-O-ß-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3¿-hydroxymethyl-3¿-methylallyl)-benzene, 1-O-(4¿¿-O-caffeoyl)-ß-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3¿,3¿-dimethylallyl)-benzene and 1-O-ß-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3¿-hydroxy-3¿-methylbutyl)-benzene; the lignan 7,7¿-bis-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-8,8¿-dihydroxymethyl-tetrahydrofuran-4-O-ß-glucopyranoside; and the acetophenone glucoside 12-O-ß-glucopyranosyl-9ß,12-dihyroxytremetone. The known flavonoids apigenin 7-O-ß-glucopyranoside, luteolin 7-O-ß-glucopyranoside, luteolin 7-O-ß-glucuronide, the acetophenone picein and 3,5- and 4,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl esters and their free carboxyl analogues were also isolated. Eight of them were tested for dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity inhibitory activity, being luteolin 7-O-ß-glucopyranoside the most active. In order to determine the antioxidant activity of the anti-inflammatory phenolic principles, we studied their effect on lipid peroxidation and superoxide free radical systems. The presence of the caffeoyl moiety is essential for both the antiperoxidative and radical scavenging activities, and the methylation of the quinic carboxyl group enhances the potency on xanthine oxidase inhibitory activity. Finally, the last study undertake the assessment of the in vitro activity of the same compounds as above on the neutrophil, a biological system that allows the evaluation of some functions relative to the inflammatory process. The parameters measured were elastase release, myeloperoxidase activity and superoxide and leukotriene B4 production from polymorphonuclear leukocytes.