Borreliosis de Lymeestudio de posibles vectores ixódidos y evaluación de métodos de diagnóstico microbiológico.

Resumen

Zoonosis causada por bacterias del género Borrelia. por la transmisión accidental por garrapatas infectadas. El género Borrelia. pertenece a la familia Spirochateaceae, y son 4 las causales de la borreliosis de Lyme, asociadas en el complejo Borrelia burgdorferi sensu lato ( B. burgdorferi sensu stricto,B. afzelii, B. garinii y B. Valaisiana) La adherencia de 48 horas es el mínimo exigido, para la inoculación de Borrelia burgdorferi sensu lato Diagnóstico de borreliosis de Lyme: Diagnóstico directo a partir de diferentes muestras clínicas al observarse fácilmente empleando colorantes convencionales, Cultivo enmedio de BSK, técnicas de amplificación y la detección mediante sondas de ADN específico. En el diagnóstico indirecto se emplean como métodos de referencia, el enzimoinmunoanálisis como prueba de cribado y la inmunotransferencia para la confirmación. Objetivos: 1.- Obtener y caracterizar ixódidos procedentes de distintas áreas de la provincia de Valencia. 2.- Determinar la presencia de Borrelia burgdorferi sensu lato en los ixódidos obtenidos. 3.- Seleccionar muestras clínicas con resultado en la prueba de cribado EIA positivo. 4.- Analizar dichas muestras mediante otras pruebas específicas y confirmatorias así como evaluar la presencia de reactividad cruzada con otros procesos nosológicos. 5.- Estudiar las características clínicas y evolución de los pacientes con marcadores serológicos sugestivos de borreliosis de Lyme así como evaluar su significación. Materiales y métodos. Obtención y caracterización de ixódidos, se procedió a la detección de Borrelia burgdorferi mediante estudio microscopico, cultivo y PCR. La selección de muestras clínicas, se realizó mediante el método de cribado EIA, y el estudio de reactividad cruzada y su confirmación mediante pruebas específicas. Y por último, se realizó el análisis de signos y síntomas clínicos y su relación con las resultados serológicos. Se realizaron macerados y disecciones a los que se practicó un estudio microscópico y cultivo en BSK II. Ya en el 2º periodo, se procedió a la detección de B. Burgdorferi mediante técnicas de PCR. anidado, utilizando 2 parejas de iniciadores del gen de Osp A, según el método de Guttman y colaboradores, que permiten obtener en la 2ª amplificación, un fragmento de 345 pares de bases. Para el gen de la flagelina, utilizamos igualmene 2 parejas de iniciadores del gen de la flagelina, según el método de Lebech y colaboradores. que permiten obtener en la 2ª amplificación, un fragmento de 275 pares de bases. Para el estudio serológico, se utilizó en primer lugar un método de cribado EIA IgM-IgG Sistema VIDAS LYT (de bioMèrieux) y un método complementario IFI Lyme Spot (también de bioMèrieux) que determina anticuerpos de clase IgM e IgG por separado. Como método confirmatorio, se utilizó la inmunotransferencia B. burgdorferi cepa B31 (de MarDx Diagnostic) y B. garinii genogrupo 2 (de Gull Laboratories). La reactividad serológica cruzada, se llevó a cabo frente a Treponema pallidum, Coxiella burnetii, Rickettsia conori y Brucella mellitensis, virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus y virus de la inmunodeficiencia humana. La población de pacientes se correspondió con los atendidos en el área del HGUV Conclusiones: 1.-La colección e identificación de garrapatas ixódidas procedentes de diferentes áreas de la provincia de Valencia, ha revelado la existencia de cinco géneros, con siete especies distintas. Ninguno de ellos, clasificado como Ixodes ricinus, reconocido principal vector de la borreliosis de Lyme. 2.-En ninguna de las garrapatas estudiadas se ha identificado una espiroqueta compatible con Borrelia burdorferi sl. u otra especie de Borrelia asociada a un cuadro de borreliosis de Lyme. 3.-Consideramos que el método más adecuado para el estudio microbiológico en los ixódidos, es la disección de las garrapatas con extracción de sus estructuras glandulares e intestinos medios. El uso de ejemplares macerados para detección por métodos moleculares es desaconsejado por la probable inhibición de la amplificación del ADN específico. 4.-El método de enzimoinmunoanálisis como prueba de cribado, selecciona una población de pacientes con características clínicas muy variables, pero también un grupo de pacientes con manifestaciones características y con una concreta evolución clínica, que sustentan la existencia de casos probables de borreliosis de Lyme. 5.-La titulación de los anticuerpos específicos de clase IgM e IgG mediante inmunofluorescencia y los criterios establecidos para la interpretación de las pruebas confirmatorias de inmunotransferencia con antígenos de B. burgdorferi y B. garinii, se muestran escasamente rentables en nuestro medio, ya que no permiten confirmar ni descartar la existencia de la enfermedad en el grupo de pacientes estudiados. Todo lo cual nos permite considerar la necesidad de un mejor estudio epidemiológico y clínico de los casos sospechosos de borreliosis de Lyme, y particularmente el desarrollo de criterios de diagnóstico microbiológico que se adecuen al perfil de la enfermedad en nuestra área. ____________________________________________________________________________________________________ SUMMARY Zoonosis caused by bacteria of the genre Borrelia. by the accidental transmission by infected ticks. The genre Borrelia. concerns to the family Spirochateaceae, and they are 4 the grounds of Lyme's borreliosis, associated in the complex broad Borrelia burgdorferi sensu (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii and B. Valaisiana) The adherence of 48 hours is the demanded minimum, for the inoculation of Borrelia burgdorferi sensu lato. Diagnostic of the Lyme borreliosis: Direcly diasnostic by detection of spirochaeta with the uses of the clinical specimens (skin biopsies, CSF semple, peripheral blood, etc.) of patients whith conventional laboratory tintions is relative easy to reconized. Culture of the organism in BSK medium, molecular characterization of Borrelia isolates by gene sequences from DNAs amplified (flagellin (flaB), and outer surface protein A (ospA)) from ticks or patiens confirmed the presence of several Borrelia species. In the indirect diagnosis use as methods of reference, the enzimoinmunoanálisis as test of screening and the inmunotransferencia for the confirmation Objetivos: 1.- Recolection and caracterization of ixodid ticks from diferent areas of Valencia countri. 2.- Investigated la presencia de Borrelia burgdorferi sensu lato in these ixode ticks recolected., 3.-To select clinical samples with result in the test of screening positive EIA. 4.-To analyze the above mentioned samples by means of other specific and confirmatory tests(proofs) as well as to evaluate the presence of cross-reactivity with other processes nosológicos. 5.-To study the clinical characteristics and evolution of the patients with serologic results suggestive of borreliosis of Lyme as well as to evaluate his significance. Materials and methods: Obtaining and characterization of ixodids, one proceeded to the detection of Borrelia burgdorferi by means of microscopic study, culture and PCR. The selection of clinical samples, it was realized by means of the method EIA, and the study of crossed reactivity and his confirmation by means of specific tests. And finally, there was realized the analysis of signs and clinical symptoms and his relation with results serológicos. There were realized softened and dissections those who a microscopic study was practised and culture in BSK II. In the 2º periode, we made a molecular characterization of B. Burgdorferi from ticks by gene sequences DNAs amplified (nexteed PCR using 2 primers of gen of outer surface protein A (OspA), by el Guttman metode et all that permeted the obtention in the 2ª amplification, a fragment of 345 pairs of bases. By the flagelina, gene, we using too 2 pairs of primers of the flagelin gene, by the Lebech metode et al. That allow to obtain in 2 ª amplification, a fragment of 275 bases pair. For the serologic study, there was in use first a method of sifted EIA IgM-IgG System VIDAS LYT (of bioMèrieux) and a complementary method IFI Lyme Spot (also of bioMèrieux) that determines antibodies of class IgM and IgG separately. As confirmatory method, there was in use the inmunotransferencia B. burgdorferi B31 (of MarDx Diagnostic) and B. garinii genogrupo 2 (of Gull Laboratories). The serologic cross reactivity, whith Treponema pallidum, Coxiella burnetii, Rickettsia conori and Brucella mellitensis, Epstein-Barr virus, Citomegalovirus virus and AIDS virus. The population of patients corresponded(fitted) with the attended ones in the area of the HGUV. Conclusiones: 1.-The collection and identification of ixodid ticks proceeding from different areas of the province of Valencia, it has revealed the existence of five genres, with seven different species. None of them, classified as Ixodes ricinus, recognized principal vector of Lyme's borreliosis. 3 2.-En none of the studied ticks has been identified an espiroqueta compatible with Borrelia burdorferi sl. or another Borrelia's species associated with borreliosis of Lyme disease. 3.-We considered that the method most adapted for the microbiological study in the ixodid, is the ticks dissection with extraction of its glandular structures and medium intestines. The use of specimens softened for detection for molecular methods is dissuaded by the probable inhibition of the amplification of the specific ADN 4.-The enzimoinmunoanálisis method of as screening test, a population of patients selects with clinical very changeable characteristics, but also a group of patients with typical manifestations and with a concrete clinical evolution, which they sustain the existence of probable cases of borreliosis of Lyme. 5.-La qualifications of the specific antibodies of class IgM and IgG by means of inmunofluorescencia and the criteria established for the interpretation of the confirmatory tests of inmunotransferencia with B. burgdorferi antigens and B. garinii, prove to be scantily profitable in our way, since they allow neither confirm nor to discard the existence of the disease in the group of studied patients. Allows to consider the need of a better epidemiological and clinical study of the suspicious cases of borreliosis of Lyme, and particularly the development of criteria of microbiological diagnosis us that they serve to the profile of the disease in our area.