DES-polyacetals as polymer therapeutics for the treatment of prostate cancer

Resumen

Esta tesis se centra en el diseño de nuevos conjugados polímero-fármaco sensibles a pH para usarse como agentes únicos o en terapia de combinación para el tratamiento del cáncer hormono-dependiente, en particular cáncer de próstata. Éstos conjugados se basan en sístemas poliacetalicos previamente descritos en los que el fármaco forma parte de la cadena principal del polímero. En el microambiente tumoral o después de la absorción celular por endocitosis, el descenso del pH encontrado en el compartimiento ácido del endosoma lisosomal, desencadena la degradación del polímero y como consecuencia la liberación del fármaco que se difunde fuera en el citosol. Para el diseño de éstos sistemas, la necesidad de optimizar la química de enlace para unir el fármaco al polímero está por lo tanto superada, ya que en éstos sistemas poliacetalicos el fármaco forma parte de la cadena principal. El dietilestilbestrol (DES), estrógeno sintético que fue utilizado como fármaco y es clínicamente relevante en el tratamiento del cáncer de próstata, posee una funcionalidad adecuada (grupos dioles) para llevar a cabo dicha incorporación a la cadena polímerica base. Una clara degradación dependiente del pH y ensayos de prueba de concepto in vitro se obtuvieron con la primera generación de poliacetales. Sin embargo presentaron algunas limitaciones, que incluyen; una estructura no única, heterogeneidad en la composición, carga de fármaco bajo y una alta polidispersidad, afectando el comportamiento farmacológico y reproducibilidad de los resultados terapéuticos de este nanoconjugado basado en polímero. El objetivo principal de esta tesis es avanzar un paso más hacia una segunda generación de conjugados poliacetalicos para el tratamiento del cáncer de próstata como agentes únicos, modificando y entendiendo la química del polímero/ conformación en disolución (capítulo 4) y como conjugados de combinación a base de polímero (capítulo 5) con el fin de lograr un posible candidato clínico. Por lo tanto se ha desarrollado una segunda generación de sistemas poliacetalicos con DES con una mejorada estructura que la primera generación utilizando una metodología de bloque-co-polímero. El control y optimización de la síntesis para obtener los bloque-co-polímeros de DES demostraron beneficiosos resultados, obteniendo distribuciones de polidispersidad más estrechas y mayor capacidad de carga de fármaco. Otro de los mayores intereses en ésta tesis se centró en la comprensión de si pequeñas modificaciones estructurales podían influir significativamente en el rendimiento del conjugado terapéutico. Para ello, ambos polímeros, Ter-DES (primera generación) y bloque-DES (segunda generación), fueron caracterizados fisicoquímicamente y biológicamente in vitro e in vivo en modelos celulares de cáncer de próstata seleccionados. La conformación adoptada por los conjugados en disolución (tamaÑo y forma) fueron estudiados mediante microscopía electrónica de transmission y barrido (TEM and SEM, resp.), dispersión dinámica de la luz (DLS), gradiente de pulsos de eco spin NMR (PGSE-NMR) y dispersión de neutrones de ángulo pequeÑno (SANS). Usando éstas técnicas fueron encontradas marcadas diferencias entre ter-DES y bloque-DES. Mediante TEM se observaron particulas bien definidas de 100nm de diametro para el bloque-DES en gran abundancia a una concentración en disolución de 3 mg/ml mostrando una superficie más globular mediante SEM. El tamaÑo de particula y la estabilidad de los agregados formados fueron confirmados mediante medidas de DLS a diferentes concentraciones de conjugados (1 mg/mL y 3 mg/mL, siempre por encima del CAC). Al contrario que para el bloque-polímero, para el ter-DES no fue posible obtener una indicación del tamaÑo de particular con ninguna de las técnicas. Tras exhaustivos estudios conformacionales utilizando varias técnicas como SANS y PGSE-NMR (llevadas a cabo con la colaboración de la Dra. Paul en la Universidad de Cardiff), se demostró que la estructura molecular de los conjugados tiene un efecto significativo sobre el comportamiento en disolución, incluso con el mismo contenido de DES. En disolución acuosa el ter-DES se presenta como un sistema individual de 20nm de diámetro y 2nm de espesor. Por otro lado, para el bloque-DES se presentan dos sistemas, uno con forma similar pero mayor longitud que el ter-DES (100 nm longitud, 2 nm espesor) y un segundo y más abundante sistema con una conformación en forma de disco (80 nm diametro, 10 nm espesor), siendo ésta segunda especie más abundante y consistente con el tamaÑo de la estructuras observada mediante TEM y DLS, y significantemente más grandes que las esttructuras obtenidas mediante SANS para el ter-DES. Comparandolo con el ter-DES, el bloque-DES presenta una conformación más estable y más particulada en el rango de nanotamaÑo que puede presentar major comportamiento biologico que el ter-DES en modelos celulares de cancer de prostata. Ambos poliacetales con DES mostraron claramente una degradación dependiente de pH, con una liberación del fármaco DES más rápida en condiciones acidas. El bloque-DES demostró tener una liberación de DES más rápida que el Ter-DES y una cinética de liberación de fármaco bimodal. El siguiente paso era explorar las posibles diferencias en cellular de estos conjugados en las lineas prostaticas más comunes, LNCaP y PC3. Para llevar a cabo ensayos de internalización celular o de biodistribución de los polímeros se necesita la incorporación de un marcador fluorescente (Oregon green o cyane 5.5 respectivamente) por lo que un monómero adicional, serinol, se incorporó en la cadena principal del sistema poliacetalico (descrito por primera vez por Tomlinson et al) de manera que permitía disponer de una cadena funcional lateral accesible para dicho marcador e incluso para la conjugación de otro fármaco, Paclitaxel (PTX) para formar sistemas para Terapia de Combinación. Los estudios de microscopia confocal demostraron que los conjugados de Oregon Green entran en la célula mediante ruta endocítica siendo el porcentaje de Bloque-DES mayor que el que se observa para el ter-DES en ambas líneas celulares. Las diferencias obtenidas en los estudios de liberación de fármaco junto con la internalización celular, probablemente inducidas por una forma esférica, dieron como resultado un aumento en la citotoxicidad para el bloque-DES en las lineas celulares LNCaP y PC3, mostrando un efecto significante con el contenido de DES. Tambien se llvaron a cabo estudios de mecanismos de acción ara corroborar si la diferente conformación de disolución induce a diferencias en la citotoxicidad. Se llevaron a cabo estudios preliminares in vivo en colaboración con el CIBBIM Nanomedicina del Hospital Vall d’Hebron de Barcelona. Estos estudios se hicieron en modelos xenográficos con células humanas de cáncer de colon, obteniendo una toxicidad negativa para los poliacetales con DES hasta 10 mg/kg y una clara acumulación en tumor hasta el día 17 para el Ter-DES. No se encontró una significante actividad antitumoral en modelos xenográficos de células de cáncer de próstata PC3 con los conjugados individuales, por lo que se empezó a estudiar los sistemas de Terapia de Combinación. Los poliacetales para combinación fueron exhaustivamente caracterizados y evaluados biológicamente tal y como se hizo para los poliacetales individuales. Los estudios con SANS demostraron claramente que la incorporación del segundo fármaco PTX, domina sobre la estructura formada en disolución. Los ensayos de eficacia in vitro se realizaron en líneas celulares de cáncer de mama y próstata y mostraron un claro sinergismo cuando ambos fármacos, DES y PTX, fueron combinados en el mismo sistema y con diferentes arquitecturas Tert- o Block-. Los ensayos in vitro en células de cancer de mama dieron una mayor toxicidad para los poliacetales con ambos fármacos poliacetales-DES-PTX comparandolos con los resultados de PTX a solas. En células de cáncer de próstata independientes de andrógenos como son las células PC3, el poliacetal Tert-DES-Ser-PTX pareció ser más activo que el PTX a solas. Por el contrario en células dependientes de andrógeno como la línea celular LNCaP Block-DES-Ser-PTX mostró mayor citotoxicidad que el PTX solo o el conjugado poliacetalico Tert-PTX (sin el fármaco DES). No se observaron diferencias significativas con lo que respecta a los estudios de internalización celular con los conjugados de combinación. Sin embargo las cinéticas de captación fueron muy influenciadas dependiendo la línea celular empleada. Cuando los polímeros de combinación fueron conjugados a Cy5.5, los estudios de biodistribución in vivo mostraron acumulación en el tumor siendo máximo a las 3 horas de administración del conjugado. También se detectó acumulación en los riñones y en el hígado indicando que la excreción de los poliacetales se producía a través de las rutas hepáticas y renales sin observar ninguna señal de toxicidad en los órganos. Actualmente se están llevando a cabo estudios de tolerabilidad in vivo y eficacia terapéutica de todos los sistemas usando ortotópicos de cáncer de próstata (células de cáncer de próstata dependientes de andrógeno LNCaP). También se están realizando estudios no invasivos intraprostáticos con tumores de PC3 de crecimiento de tumor y metástasis in vivo y ex vivo para confirmar los resultados.