Caracterización funcional de GTPBP3una proteína G implicada en la modificación de tRNAs mitocondriales.

Resumen

Determinadas enfermedades mitocondriales, como MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), MERRF (myoclonus epilepsy associated with ragged-red-fibers), cardiomiopatía hipertrófica y acidosis láctica dependiente de GTPBP3, cardiomiopatía hipertrófica infantil y acidosis láctica dependiente de MTO1 y fallo hepático infantil agudo dependiente de TRMU, están asociadas con una disfunción severa del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) que, se cree, podría ser resultado de defectos en la modificación postranscripcional de la uridina localizada en la posición de tambaleo (U34) de ciertos tRNAs mitocondriales (mt-tRNAs) y, por consiguiente, de un mal funcionamiento de la traducción mitocondrial. A partir de la alta conservación evolutiva del proceso de modificación de la U34 se ha sugerido que las proteínas humanas TRMU, GTPBP3 y MTO1 desempeñan las mismas funciones que sus homólogas en levaduras y bacterias. GTPBP3 y MTO1 se encargarían de introducir el grupo taurinometil en la posición 5 de la U34 en los mt-tRNAs Leu, Lys, Glu, Gln y Trp, mientras que, TRMU introduce el grupo tiol en la posición 2 de la U34 de los mt-tRNAs Lys, Glu y Gln. En humanos, mutaciones en GTPBP3 causan cardiomiopatía hipertrófica y acidosis láctica, y han sido asociadas con defecto en la traducción mitocondrial, aunque el mecanismo patogénico no está claro. En esta tesis utilizamos un sistema modelo donde GTPBP3 se encuentra silenciado establemente (células shGTPBP3) para conseguir una caracterización más profunda del fenotipo conferido por la deficiencia de GTPBP3 y poder estudiar el mecanismo molecular subyacente. Usando un ensayo de sensibilidad a la digestión por angiogenina de los mt-tRNAs, que validamos con tRNAs de Escherichia coli, demostramos experimentalmente por primera vez que la falta de GTPBP3 está asociada con hipomodificación del mt-tRNA, puesto que los mt-tRNAs de las células silenciadas para GTPBP3 son más sensibles a la digestión con angiogenina que los de las células control. A pesar de que el efecto del silenciamiento estable de GTPBP3 sobre la síntesis mitocondrial de proteínas global es bastante suave, observamos una disminución del 50% en los niveles estacionarios y actividad del Complejo I del sistema OXPHOS, así como en los niveles de ATP celular en las células shGTPBP3 respecto a las células control. Llamativamente, la actividad ATPasa del Complejo V se encuentra incrementada un 40% en las células shGTPBP3, sugiriendo que la mitocondria consume ATP para mantener el potencial de membrana mitocondrial. Además, las células shGTPBP3 exhiben una capacidad antioxidante aumentada y un incremento de casi dos veces en los niveles de la proteína desacoplante UCP2. Los datos obtenidos indican que el silenciamiento estable de GTPBP3 inicia una señalización retrógrada dependiente de AMPK que disminuye los niveles de mRNA de los factores de ensamblaje del Complejo I NDUFAF3 y NDUFAF4 y la expresión (a nivel de mRNA y de proteína) del transportador del piruvato (MPC), mientras que favorece la sobreexpresión de UCP2. Además, hemos observado sobreexpresión de algunos genes implicados en glucólisis y oxidación de ácidos grasos. Estos datos son compatibles con un modelo donde los altos niveles de UCP2 junto con la reducción del transportador del piruvato MPC promueven un cambio metabólico, disminuyendo la oxidación del piruvato en la mitocondria y favoreciendo su utilización por parte de lactato deshidrogenasa mientras que se estimula la oxidación de ácidos grasos. Este cambio metabólico produciría un desacople entre la glucólisis y la fosforilación oxidativa y esta alteración metabólica, junto con los bajos niveles de ATP, puede afectar negativamente la función del corazón.