Identificació i caracterització de transportadors de coure d'alta afinitat d'Arabidopsis thaliana

Resumen

La tesi doctoral semmarca dins de làrea de la biologia molecular de plantes, incloent algunes consideracions de tipus fisiològic, i descriu la identificació i caracterització de 5 gens Arabidopsis que codifiquen proteïnes amb similitud estructural amb els transportadors de coure eucariotes de la família Ctr. Els resultats del treball shan dividit en tres capítols. En el primer dells sanalitza a nivell teòric les seqüències dels polipèptids de la família COPT dArabidopsis, sinvestiga la seua funcionalitat en un sistema dexpressió heteròleg i es caracteritza de forma global el perfil dexpressió dels gens de la família. En aquest apartat es mostra que COPT1 i COPT2 restableixen amb gran eficiència el creixement en medi de selecció duna soca de llevat deficient en el transport de coure dalta afinitat i s'estableix que lexpressió dels dos transportadors es reprimeix en resposta a un tractament amb dosis tòxiques de coure. Per un altre costat, COPT3 i COPT5 complementen amb baixa eficiència al mutant de llevat i no responen al tractament amb coure. Les conclusions daquest primer apartat permeten proposar un model sobre la localització i funció cel·lular dels transportadors de la família. Els altres dos capítols de la tesi es centren específicament en lestudi del gen COPT1. En el segon capítol, es descriu lobtenció de plantes transgèniques que expressen un gen quimèric format per la fusió del promotor de COPT1 al gen GUS. Lanàlisi histoquímic daquestes plantes permet dilucidar que el gen COPT1 sexpressa en embrions i plàntules dArabidopsis. A més, en plantes adultes, lexpressió de COPT1 es restringeix als àpex radiculars, als tricomes, a les cèl·lules guarda i al pol·len. En lúltim capítol de la tesi sexposa lanàlisi fenotípic de plantes transgèniques que sobreexpressen i silencien COPT1, focalitzant lestudi en els teixits descrits en el capítol anterior. Així, es mostra que la sobreexpressió de COPT1 causa hipersensibilitat al coure i lactivació dels sistemes de segrest cel·lulars, representats per la metal·lotioneïna MT1a. Daltra banda, el silenciament postranscripcional de COPT1 causa una reducció en labsorció de coure, hipersensibilitat al dèficit de coure, un allargament de larrel primari i irregularitats en la formació de la coberta dexina. Globalment, els resultats de la tesi descriuen per primera vegada lexpressió dun transportador de coure als arrels duna planta superior i assenyalen la participació de COPT1 en labsorció de coure i en altres processos fisiològics i del desenvolupament vegetatiu i reproductiu dArabidopsis thaliana. -------------------------------------------------------------------------------------------------<BR> SUMARY<BR> The work presented in this thesis describes the identification and characterization of 5 genes (COPT1-5) encoding putative Ctr-like Arabidopsis copper transporters. The first chapter encompasses a theoretical comparison of the COPT protein sequences, a functional study in a heterologous system and a preliminary expression and copper-regulation pattern analysis. COPT1 and COPT2 restore with high efficiency the growth of a yeast strain deficient in high affinity copper uptake and both genes are downregulated by exposure of leaves to copper treatment. COPT3 and COPT5 poorly substitute for their yeast counterparts and do not respond to copper treatment. Based on these results, a model for the cellular function of the COPT family members is proposed. The second chapter describes the generation and analysis of transgenic plants expressing a GUS reporter gene under the control of the COPT1 promoter. GUS specific staining is specifically detected in embryos, cotyledons, root tips, tricomes, guard cells and pollen grains. The last chapter describes the generation and phenotypical analysis of Arabidopsis transgenic plants overexpressing and silencing the COPT1 gene. Overexpression of COPT1 causes enhanced copper sensitivity and constitutive activation of the metallothionein gene MT1a. Overexpressing the complementary sequence of COPT1 produces a reduction in copper absorption, enhanced sensitivity to copper deficiency, increased root length and abnormalities in the pollen exine layer. Overall, the results presented here describe for the first time the expression of a copper transporter in the roots of a higher plant and indicate the participation of COPT1 in copper uptake and other physiological and developmental processes of Arabidopsis thaliana