Papel de eNOS, nNOS y NT-3 en patología cardiovascular y angiogénesis

Resumen

El óxido nítrico es un mediador implicado en el desarrollo de la patología cardiovascular, la principal causa de mortalidad en nuestro entorno, pero su papel no ha sido completamente esclarecido. Recientemente, se ha establecido el mecanismo a través del cual actúa la NT-3 liberada en el endotelio vascular y se ha demostrado su capacidad para, a través de la activación de su receptor TrkC, fosforilar la eNOS y, como consecuencia, aumentar la síntesis de NO en las células que expresan este receptor junto con eNOS. A su vez, también se ha demostrado recientemente la implicación de la otra isoforma constitutiva de la NOS, la nNOS, en la homeostasis cardiovascular. Por todo ello, en la presente Tesis Doctoral se ha estudiado el papel de NT-3, eNOS y nNOS en la patología cardiovascular humana, focalizando la atención en el proceso angiogénico por ser un factor clave tanto en el desarrollo como en la recuperación de los trastornos cardiovasculares. Para ello se ha trabajado con muestras humanas de corazón y linfocitos circulantes procedentes de sujetos sanos y de pacientes con distintas patologías cardiovasculares como hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca o pulmonar, trasplante cardiaco o antecedentes de muerte súbita por taquicardia ventricular catecolaminérgica polimórfica. Además, se ha analizado en animal de experimentación el papel de eNOS, nNOS y NT-3 en el proceso angiogénico, seleccionando para ello un modelo “ex vivo” que permite el crecimiento de nuevos vasos a partir de un anillo de aorta de rata incubado en una matriz tridimensional. Por lo que respecta a la patología cardiovascular humana, se ha observado que existe variabilidad de expresión de eNOS y nNOS en pacientes con IC que no depende del tratamiento farmacológico ni de las distintas etiologías de la enfermedad, lo cual justifica las discrepancias de resultados descritos en la literatura. Además, la distinta localización celular y subcelular de ambas isoformas puede ser el motivo por el cuál los niveles de expresión son tan distintos a nivel de miocardio. En cambio, los niveles de NT-3 se encuentran aumentados en IC con respecto a voluntarios sanos y ese aumento coincide con los pacientes con miocardiopatía dilatada. Tras realizar diversas correlaciones entre los niveles de ARNm de los 3 genes y las variables clínicas propias de cada patología, los resultados obtenidos muestran que el NO procedente de la isoforma endotelial (eNOS) correlaciona de forma inversa con el diámetro del Vi en pacientes insuficientes pero de manera directa en los trasplantados, lo cual sugiere una doble actividad del NO, por un lado como cardioprotector evitando una excesiva hipertrofia cardiaca en corazones insuficientes y, por otro lado, como regulador de la distensibilidad en corazones trasplantados. Además, eNOS también correlaciona inversamente con la PAP de pacientes insuficientes pero, a su vez, su expresión es superior en pacientes con niveles normales de PAP con respecto a pacientes con HP, de manera que, la regulación selectiva al alza de la enzima podría ser un objetivo prometedor en el tratamiento de la hipertensión pulmonar asociada a la insuficiencia cardiaca. Por lo que respecta a nNOS, existe correlación directa entre nNOS y el gasto cardiaco, como parámetro que determina la funcionalidad del corazón, lo que sustenta la posibilidad de la relación del NO con la inervación nitrérgica implicada en la contractilidad cardiaca. Diversos estudios han determinado la regulación común existente entre NT-3 y eNOS a nivel vascular. Nuestros resultados corroboran dicha observación en miocardio, ya que existe correlación directa entre ambos genes independientemente de la cavidad estudiada. Además, la correlación inversa existente entre los niveles de ARNm de NT-3 y la PAP diastólica corrobora de nuevo el mecanismo común de regulación de eNOS y la neurotrofina y sugiere, nuevamente, importantes dianas terapéuticas. Teniendo en cuenta que tanto nNOS como NT-3 son dos moléculas implicadas en el desarrollo y función neuronal, nos propusimos determinar su posible implicación en la inervación cardiaca del miocardio. Efectivamente, existe un aumento de expresión de ambos genes en los corazones trasplantados que están siendo sometidos a un proceso de reinervación y, además, en el caso de NT-3, se corrobora su implicación en la inervación simpática del corazón por la correlación directa encontrada con los adrenoceptores. Además del miocardio, también trabajamos con linfocitos circulantes, utilizados como biomarcadores del estado del músculo cardiaco. Los resultados obtenidos demuestran que este no es un escenario general para todos los genes. En el caso de NT-3 sí que existe similitud en su expresión en linfocitos y miocardio en corazones insuficientes, pero no ocurre lo mismo con eNOS. Por otra parte, se trató de ver si alguno de los 3 genes correlacionaba con los días trascurridos desde el TC. Los resultados muestran como solo en el caso de eNOS existe correlación directa tanto el linfocitos como en miocardio, lo cual puede ser indicativo de que el NO parece que dirige hacia una normalización en la función endotelial guiada por la enzima mientras se restauran los valores clínicos que indican una funcionalidad cardiaca recuperada. La angiogénesis es un proceso implicado en diversas patologías cardiovasculares. Por ello, se ha tratado de poner a punto la técnica en nuestro modelo y, además, se ha analizado los cambios de expresión de eNOS, nNOS y NT-3 durante el proceso. Además, puesto que el NO juega un papel trascendental a nivel cardiovascular y su importancia en el endotelio vascular ha sido profundamente estudiada como mediador de la angiogénesis, se ha determinado su función en nuestras condiciones experimentales. Por todo ello, se ha trabajado con aorta de rata en medio de cultivo adicionado con factores de crecimiento como condiciones que reproducen lo que ocurre fisiológicamente. Además, se demuestra como tanto la capa endotelial como la capa adventicia de aorta están implicadas en el crecimiento de nuevos vasos, sin embargo, la pérdida de la capa adventicia supone la destrucción de las células precursoras endoteliales, lo cual da lugar a la supresión del inicio del proceso. Por otro lado, la pérdida de expresión de nNOS y NT-3 en distintas etapas del proceso angiogénico y en anillos quiescentes, hace pensar que no son las condiciones del cultivo lo que dan lugar a la pérdida, si no la eliminación de las terminaciones nerviosas que irrigan el vaso. En el caso de eNOS, su expresión no se pierde ni durante el proceso, ni en anillos quiescentes. Sin embargo, la separación del anillo y los nuevos vasos formados, da lugar a la pérdida de expresión de la isoforma endotelial en estos últimos, lo cual parece indicar que el NO procedente de eNOS es indispensable para la comunicación entre células. En el cultivo angiogénico, el aumento de crecimiento de nuevos vasos utilizando L-NAME y la disminución de éste con elevadas dosis de NO demuestran la implicación del mediador como protector del crecimiento anómalo de nuevos vasos. Además, parece que las rutas implicadas son distintas. Sin embargo, el crecimiento de nuevos vasos alterado que tienen los animales con hipertensión arterial o síndrome metabólico, no es revertido utilizando L-NAME o SMTC, lo cual demuestra, nuevamente, que el NO está implicado activamente en el proceso.