Citotoxicidad ejercida por el herbicida bipiridílico paraquat sobre la microalga dulceacuícola Chlamydomonas moewusii Gerloff

Résumé

El conocimiento cada vez mayor de los efectos perjudiciales de la contaminación sobre los ecosistemas acuáticos ha hecho cambiar la estrategia tradicional de búsqueda de métodos de restauración o recuperación ambiental hacia una estrategia de prevención de la entrada de potenciales contaminantes en el medio. Con este cambo de actitud, surge la necesidad de métodos para predecir la toxicidad de diversas sustancias que pueden ser liberadas al ambiente y ejercer un potencial daño en el ecosistema. En este sentido, los ensayos de toxicidad basados en la respuesta de organismos como las microalgas se han revelado como un método fiable y sensible que proporcionaría una alerta temprana a la presencia de niveles potencialmente peligrosos de polución en ecosistemas acuáticos, puesto que cualquier alteración que se produzca en los organismos fitoplanctónicos, productores primarios por excelencia, va a repercutir en niveles superiores de la cadena trófica, pudiendo dar lugar a modificaciones estructurales y funcionales permanentes en el ecosistema. Entre los principales contaminantes presentes en los ecosistemas acuáticos, los pesticidas representan un problema ambiental grave. A pesar de que los herbicidas son diseñados para proteger los cultivos, eliminando las malas hierbas, su utilización masiva puede generar efectos adversos en los ambientes acuáticos. Dada la similitud ecofisiológica entre las microalgas y las células vegetales, los herbicidas, que alcanzan los ecosistemas acuáticos a través de los efluentes agrícolas o que son aplicados directamente al medio acuático para la eliminación de cierta vegetación, van a ejercer su toxicidad sobre estos microorganismos fotosintéticos esenciales en la base de la cadena trófica de estos ecosistemas. En base a esto, el objetivo general de este trabajo es la evaluación de la citotoxicidad del herbicida bipiridílico paraquat y de las respuestas desencadenadas en las células de la microalga dulceacuícola Chlamydomonas moewusii, a través del análisis de diferentes parámetros, lo que permitirá además determinar la aplicabilidad de cada uno de ellos en estudios ecotoxicológicos con esta microalga. Se estudian parámetros habitualmente utilizados en bioensayos de toxicidad con microalgas, como el crecimiento, diversos aspectos de la composición elemental y bioquímica de la biomasa o actividades enzimáticas implicadas en la asimilación de nitrato, parámetros que son analizados mediante técnicas tradicionales cuyos resultados se refieren a valores medios de la población celular analizada, sin tener en cuenta la posible heterogeneidad dentro de esta población. Por otro lado, se ponen a punto diversos protocolos de ensayo que permiten estudiar la respuesta de la microalga al paraquat a nivel de la célula individual, para la evaluación de la genotoxicidad asociada a dicho herbicida, en base al ensayo del cometa, y de los efectos sobre diversos parámetros relacionados con la fisiología y estructura celular, mediante citometría de flujo. El crecimiento y viabilidad celular de los cultivos de C. moewusii se ven afectados por la adición de paraquat al medio de cultivo de una manera dependiente de la concentración y del tiempo de exposición al herbicida. El análisis mediante citometría de flujo de la autofluorescencia de la clorofila a permite observar la aparición de una subpoblación de células cloróticas en cultivos de la microalga expuestos a concentraciones del herbicida superiores a 0.05 µM, en concordancia con la reducción del contenido de clorofilas. La posibilidad de analizar por separado la subpoblación de células cloróticas mediante citometría de flujo ha permitido obtener diversos indicios de que se trata de células no viables, puesto que son células metabólicamente inactivas, con su membrana plasmática despolarizada, posiblemente como consecuencia de una pérdida de su integridad, y con un nivel reducido de proteínas y lípidos neutros en comparación con las células de los cultivos control. En base al ensayo del cometa se ha podido demostrar la genotoxicidad del herbicida paraquat sobre C. moewusii. Este ensayo proporciona un sistema sensible y rápido para la detección de daños primarios sobre el ADN en esta microalga, sugiriendo asimismo la idoneidad de este organismo para la evaluación de la genotoxicidad de cualquier agente contaminante. Los resultados obtenidos mediante citometría de flujo han permitido caracterizar la respuesta de esta microalga al herbicida paraquat a diferentes niveles de la fisiología celular (niveles intracelulares de ión superóxido y peróxido de hidrógeno, potencial de membrana citoplasmática, actividad esterasa inespecífica, niveles de calcio citosólico libre, pH intracelular y potencial de membrana mitocondrial), avalando la utilización de estos parámetros fisiológicos como biomarcadores en ensayos de toxicidad, tanto crónicos como agudos. Mientras que el análisis cuantitativo del estrés por citometría de flujo se ha realizado con relativa frecuencia en células animales, no existen apenas trabajos en células vegetales como las microalgas, ni en estudios de relevancia biológica, ni en estudios con aplicación ecotoxicológica, a pesar de las ventajas analíticas de la técnica en general y aplicada a la Microbiología y Toxicología en particular. De este modo, la utilización de la citometría de flujo en estudios de ecotoxicología con microalgas como C. moewusii puede significar un gran avance en los estudios experimentales de laboratorio con repercusión ecológica.