Sensores basados en nanopartículas de conversión ascendente para la detección de oligonucleótidos de ARN / ADN

Resumen

Los miARNs son secuencias cortas no codificantes de ácido ribonucleico, ARN, con un importante rol en la regulación celular de la traducción génica. La desregulación de su expresión conlleva un profundo impacto en el correcto funcionamiento de la célula, como así prueban los perfiles anormales de expresión de miARNs en enfermedades como la de Alzheimer o distintos tipos de cáncer. Debido a esto, dichos perfiles tienen gran potencial como marcadores tempranos para el diagnóstico y pronóstico de distintas enfermedades. Los últimos avances en nanotecnología están empezando a ofrecer herramientas para la cuantificación y detección directa de miARNs sin necesitar técnicas de amplificación por PCR o métodos similares, con el potencial de sortear las desventajas inherentes a dichas técnicas. En la ultima década se han desarrollado nanopartículas de conversión ascendente, UCNPs, nanocristales fotoluminiscentes capaces de ser excitados con luz en la región infrarroja cercana, NIR, y mostrar emisiones de tipo antiStokes en la región del UV y visible. El proceso antiStokes producido por las UCNPs junto con las propiedades fisicoquímicas de estas nanopartículas permiten evitar algunas de las limitaciones más importantes que surgen cuando se usan fluoróforos orgánicos tradicionales, como son la autofluorescencia, el fotoblanqueado y la intermitencia de fluorescencia. Este trabajo de tesis se centra en la síntesis de UCNPs y su funcionalización superficial, estudio fundamental, bioconjugación, y uso como etiquetas para el desarrollo de sistemas de detección directa y ultrasensible de oligonucleótidos de ARN y ADN. Como introducción se explica la biosíntesis, el mecanismo, y el potencial clínico del miARN. A continuación se compara el mecanismo, las propiedades ópticas y las ventajas de las UCNPs con las de los fluoróforos orgánicos tradicionales y con los puntos cuánticos. Al final de la introducción se presenta una revisión del estado del arte de las UCNPs en biodetección. Los capítulos experimentales de esta tesis se dividen en dos secciones diferentes: La primera se centra en estudios fundamentales sobre procesos de transferencia de energía por resonancia, FRET o RET, usando UCNPs como donadores y puntos cuánticos de CdTe, Q dots, o nanopartículas de oro, AuNPs, como aceptores. En el primer trabajo se estudia experimentalmente y se explica teóricamente la dependencia de la luminiscencia de las UCNPs en función de la proximidad de los Q dots. En el segundo se estudia el efecto de distintos tamaños de AuNPs sobre la luminiscencia de las UCNPs, validando con modelos teóricos el mecanismo de dicho comportamiento. Al final de ambos trabajos se sugieren algunas recomendaciones a la hora de diseñar sensores con dichos sistemas. La segunda sección experimental se centra en la aplicación de nuevas estrategias para la detección directa de ADN y miARN en ensayos heterogéneos usando UCNPs como etiquetas. En el primer trabajo de esta sección se estudia el uso de una ligación, mediante química click, de las sondas de ADN usadas para la detección. Esta reacción está catalizada por la secuencia diana de interés, y permitió desarrollar un ensayo de detección de alta sensibilidad gracias a la fuerte unión de las UCNPs con una sonda biotinilada y su posterior captura en placas multipocillo. En el segundo trabajo se desarrolla un sistema de detección ultrasensible usando una ligación entre las sondas de detección mediada por la presencia de la sonda de interés, y cuyo progreso es controlado mediante luz UV, esto es, fotoligación. Adicionalmente se consiguió usar luz NIR como fuente de excitación externa y la emisión UV de las UCNPs como fuente local de luz para llevar a cabo la ligación de las sondas en su superficie, testándose en distintos sistemas. Esta tesis demuestra el impresionante potencial de las UCNPs como etiquetas para la detección directa y ultrasensible de oligonucleótidos de ARN y ADN.