Metabolismo de la Arginina y Daño Oxidativo en ratones ob/ob, un módelo genético de riesgo cardiovascular

Resumen

Desde hace unos años, las enfermedades cardiovasculares (ECV) se han convertido en la primera causa de morbimortalidad en los países desarrollados, afectando ya al 38% de la población española1. Numerosos estudios clínicos y estadísticos han demostrado que la etiología de la ECV es multifactorial destacando, entre los factores que la promueven, la hipertensión arterial, la diabetes mellitus, la dislipemia, la obesidad y el tabaquismo. El creciente número de estudios sobre este tema desvelan poco a poco otros factores asociados que afianzan cada vez más su posición, así como las bases moleculares subyacentes en el proceso. Entre los componentes de la dieta cuya ingesta parece afectar el riesgo cardiovascular se encuentra el aminoácido arginina. A nivel bioquímico-fisiológico, en los últimos años, numerosos estudios relacionan metabolitos biológicamente activos de la arginina con el desarrollo, aparición y progresión de la enfermedad cardiovascular2,3, tanto en humanos como en animales de experimentación. Particularmente, alteraciones en la síntesis y/o actuación del óxido nítrico (NO) han sido constatadas en la diabetes, HTA e hipercolesterolemia4, 5. Pero el metabolismo de la arginina, que es extraordinariamente complejo, incluye su utilización en otras vías como la que conduce a la síntesis de las poliaminas putrescina, espermidina y espermina6. Al igual que ocurre con el NO, para las poliaminas se han propuesto múltiples funciones7-9, algunas de ellas relacionadas con sus efectos pro-proliferativos y antioxidantes que serían, en cierto modo, opuestos a los del NO. Puesto que la arginina es el sustrato precursor tanto para la síntesis de poliaminas como para la síntesis de NO, la disponibilidad de arginina en condiciones fisiológicas, patológicas o clínicamente manipuladas podría condicionar la funcionalidad de ambas vías. De hecho existen evidencias experimentales que apoyan un control simultaneo (e inverso) de ambas vías, e incluso del propio transporte celular de arginina10. Trabajos previos de nuestro laboratorio6, 11-14 realizados en humanos y modelos animales con diferentes patologías de riesgo cardiovascular indican que éstas se asocian a diferentes alteraciones en el metabolismo global de la arginina, que responden de forma diferencial a la suplementación oral con el aminoácido. Concretamente, en ratones ob/ob15 (un modelo genético de alto RCV, en el que coinciden obesidad, hiperglucemia, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia) hemos constatado una drástica disminución de la producción de NO y una significativa variación de los niveles circulantes de la poliaminas que resultan insensibles al suministro exógeno de arginina. Estas características de los ratones ob/ob lo revelan como un excelente sistema de estudio de las alteraciones del metabolismo de la arginina que pueden subyacer a las patologías de RCV, así como de los mecanismos bioquímicos que median los beneficios de la arginina observados en humanos2,16 y otros modelos experimentales 17,18. El análisis detallado de este modelo constituye el objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral. OBJETIVOS Nuestros objetivos concretos serán: 1. Valorar en un modelo genético de ratones obesos ob/ob (un modelo de obesidad genética y riesgo cardiovascular) y controles, simultáneamente, las alteraciones de diferentes vías metabólicas que comparten la arginina, y el daño oxidativo a lípidos y proteínas mediante diferentes aproximaciones experimentales. A partir de estos datos se analizarán las relaciones existentes entre estos parámetros y su correlación con diferentes marcadores de riesgo cardiovascular. 2. Analizar el efecto de la administración oral moderada de arginina sobre los parámetros descritos en el apartado anterior. METODOLOGÍA Se plantea un estudio experimental basado en la utilización de ratones obesos genéticamente seleccionados (homocigóticos, ob/ob) y sus controles (Lean -/+), separados aleatoriamente en grupos de 5 animales, y suplementados o no con arginina al 1% en el agua de bebida. El estudio se realizará, por lo tanto, sobre cuatro grupos experimentales: control (lean) y ob/ob, alimentados con dieta estándar, y control (lean)+arg y ob/ob+arg. Los ratones serán alimentados en estas condiciones durante cuatro semanas en jaulas metabólicas, ajustando la cantidad de comida diaria a la del grupo de menos ingesta (“pair-fed”) con el fin de disminuir las diferencias atribuibles a la ingesta. Se estudiarán un mínimo de 10 animales/grupo experimental. A lo largo del estudio se registrarán diariamente la ingesta de comida y bebida y la excreción de orina. Semanalmente se valorará el incremento ponderal y se tomarán muestras de orina que serán procesadas convenientemente y valoradas conjuntamente con las de sangre, obtenidas al final del estudio, para la obtención de los datos bioquímicos relevantes para el mismo. A las cuatro semanas de la introducción de las dietas se procederá al sacrificio de los ratones, extrayéndose tanto muestras de sangre por punción cardiaca como los siguientes órganos: corazón, aorta torácica, testículos, hígado y riñones de forma completa, y parte de páncreas, músculo estriado y grasa abdominal (epididimal) y retroperitoneal. A partir de las muestras obtenidas se procederá a la evaluación de los siguientes parámetros: Parámetros del metabolismo de la arginina: Expresión tisular de mensajeros de las isoformas neuronal, endotelial e inducible de las óxido nítrico sintasas; nitrato y nitrito en plasma y orina; creatinina en orina; poliaminas (putrescina, espermidina y espermina) en sangre total y tejidos. Parámetros del metabolismo oxidativo: Actividad antioxidante total en plasma; grupos SH totales en plasma y tejidos; isoprostanos en plasma y orina; TBARM en plasma, orina y tejidos, MDA en plasma; grupos carbonilo proteicos en plasma y tejidos; productos avanzados de oxidación proteica en plasma. Parámetros de inflamación, resistencia insulínica y adipoquinas: IL-6, Insulina, Resistina y Leptina se valorarán mediante tecnología Multiplex para Luminex. Datos bioquímicos convencionales: Proteína C reactiva ultrasensible, lipoproteína A, glucemia basal, colesterol total, HDL colesterol, LDL colesterol, triglicéridos, urea, creatinina, proteínas plasmáticas, urinarias y tisulares. Los resultados del estudio serán analizados mediante el paquete estadístico SPSS v20.0 para Windows. Se utilizarán el ANOVA y el test LSD para las comparaciones entre grupos y, para las correlaciones entre variables, se recurrirá al coeficiente de correlación de Pearson. Las comparaciones se realizarán globalmente entre los grupos o tras su fraccionamiento en función de los diferentes parámetros de relevancia en el estudio. En todos los casos se considerará significativa una p<0.05. BIBLIOGRAFÍA 1. Plaza I, Villar A, Mata P, Pérez F, Máiquez A, Casasnovas JA. (2001). Control de la colesterolemia en España. Un instrumento para la prevención cardiovascular. Rev Esp Cardiol, 53: 815-837. 2. Costopoulos C, Liew TV, Bennett M. (2007). Ageing and atherosclerosis: Mechanisms and therapeutic options. Biochem Pharmacol, 13: 268-276. 3. Voghel G, Thorin-Trescases N, Farhat N, Nguyen A, Villeneuve L, Mamarbachi AM, Fortier A, Perrault LP, Carrier M, Thorin E. (2007). Cellular senescence in endothelial cells from atherosclerotic patients is accelerated by oxidative stress associated with cardiovascular risk factors. Mech Ageing Dev, 128(11-12): 662-671. 4. Gunay YA, Catravas JD. (2006). 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