Papel de la autofagia en la muerte excitotóxica

Abstract

Diversas evidencias experimentales han sugerido que la excitotoxicidad es una vía final común de daño neuronal, durante el daño cerebral agudo y en la neurodegeneración progresiva asociada con varios estados de enfermedades neurológicas. La pérdida neuronal deriva, fundamentalmente, de la sobreactivación del receptor de NMDA (NMDAR), debida a una excesiva cantidad del neurotransmisor excitatorio glutamato en los espacios sinápticos. La autofagia es una vía fundamental requerida para el mantenimiento de la homeostasis en varios tipos celulares y se ha convertido en un mecanismo particularmente relevante para el control de calidad en células post-mitóticas, que no experimentan división celular, como las neuronas. Por ello, estas células son particularmente sensibles a cambios en la degradación autofágica. Recientemente se han aportado evidencias sobre la inducción de la autofagia en el SNC bajo diversas condiciones patológicas y en concreto, ha sido descrito que la autofagia se encuentra activada en neuronas sometidas a excitotoxicidad. Por este motivo, nos planteamos como objetivo principal de esta tesis doctoral, analizar el papel de la autofagia neuronal durante la muerte excitotóxica inducida por NMDA. El control molecular de la vía autofágica está principalmente dirigido por un conjunto de genes denominados ATGs, entre los cuales cabe destacar la función de Beclina 1, como un regulador central de la vía autofágica. El estudio se planteó mediante la inhibición de la vía, a través del bloqueo de la expresión del gen ATG específico Beclina 1. Para llevar a cabo el silenciamiento génico de Beclina 1 en neuronas corticales de rata se aplicó la tecnología basada en el mecanismo de interferencia génica, mediante el empleo de un nuevo dendrímero, denominado TRANSGEDEN (TGD), el cual ha demostrado ser una prometedora molécula transportadora de siRNAs en cultivos neuronales primarios. Inicialmente comprobamos que el daño excitotóxico puede actuar como un estímulo que Resumen activa la autofagia neuronal. A continuación confirmamos que el dendrímero TGD proporcionaba elevadas eficiencias de transfección y daba lugar a la reducción de los niveles de expresión génica hasta unos valores que permitían llevar a cabo estudios de ausencia de función proteica. Así, comprobamos que el silenciamiento génico de Beclina 1 evitó el incremento de la actividad autofágica inducido por NMDA y confirmamos la importancia de la proteína como un regulador esencial de la vía. Además, la ausencia de autofagia durante el daño excitotóxico, incrementó la susceptibilidad a la muerte neuronal, lo que nos permitió sugerir que la autofagia, que se activa por sobre estimulación de los NMDARs, es una estrategia de supervivencia neuronal, más que un programa de ejecución de muerte. El siguiente objetivo planteado en esta tesis doctoral fue intentar analizar la participación de la proteína HMGB1 (High-Mobility Group Box 1) en la respuesta autofágica desencadenada frente a la excitotoxicidad. En primer lugar, encontramos que el daño excitotóxico se convierte en una importante señal que regula la localización celular de HMGB1, ya que induce su traslocación desde el núcleo hasta el citoplasma neuronal y su posterior liberación masiva al medio extracelular. Además, comprobamos que la localización citoplasmática de HMGB1 es progresiva y anterior al incremento de la actividad autofágica. Por ello, nos planteamos evaluar si HMGB1 podría participar en las fases iniciales de inducción de la autofagia como consecuencia de su interacción con Beclina 1. En este sentido, confirmamos que la interacción entre HMGB1 y Beclina 1 se incrementó paralelamente con respecto al aumento del nivel de autofagia celular en respuesta a NMDA. Por último, para confirmar la importancia de HMGB1 en la regulación de las fases iniciales de la autofagia, también llevamos a cabo la aplicación de la tecnología basada en el mecanismo de interferencia génica, mediante el empleo del dendrímero Resumen TGD. Encontramos que la disminución marcada de los niveles de expresión proteica de HMGB1, previno la inducción de autofagia durante la excitotoxicidad, indicando que HMGB1 juega un papel clave en la regulación de las fases iniciales de la vía. Además también comprobamos que el silenciamiento génico de HMGB1 incrementó la