Relaciones estructura-función de la proteína SP-C del surfactante pulmonarefectos sobre la estructura de membranas y papel del colesterol

Zusammenfassung

La función respiratoria depende de la presencia del surfactante pulmonar (SP), un complejo lipoproteico que permite la estabilización de la interfase aire-líquido respiratoria. Dos proteínas, SP-B y SP-C, son esenciales para una apropiada función biofísica. El colesterol es un importante modulador de las propiedades del surfactante, adaptándolas a diferentes entornos y situaciones fisiológicas. Aunque su origen y regulación en el SP aún se desconocen, algunos estudios han sugerido que la SP-C participa en los mecanismos de regulación o detección de los niveles de colesterol. El objetivo de la presente Tesis ha sido la caracterización de las propiedades de la proteína SP-C en contextos de membrana, estudiando particularmente sus efectos sobre la estructura y propiedades de las mismas en presencia y ausencia de colesterol. En primer lugar, estudios de espectroscopía infrarroja demostraron que la palmitoilación de la proteína no altera la estructura de la misma pero sí su orientación en membranas, propiciando una mayor inclinación de la proteína y un incremento de polaridad en las bicapas lipídicas a nivel de los grupos fosfato. Además, un análisis exhaustivo mediante resonancia magnética nuclear de deuterio permitió detectar que la SP-C induce segregación de fases en membranas surfactante-miméticas, dando lugar a una fase líquido-cristalina y una fase ordenada. Dicha fase ordenada posee características similares a una fase interdigitada y acomoda diferencialmente distintas especies lipídicas, un efecto en el que la palmitoilación de la proteína parece estar implicada. En presencia de colesterol, la segregación de fases aparece a temperaturas más bajas, sugiriendo que ambos elementos (colesterol y SP-C) modulan la estructura de las membranas de surfactante de forma conjunta. El incremento en orden lipídico inducido por la SP-C fue confirmado mediante resonancia de espín electrónico. Por otro lado, mediante el uso de un ensayo basado en anisotropía de fluorescencia se observó que tanto la SP-C como la fracción nativa de proteínas hidrófobas del surfactante, SP-B y SP-C, incrementan de forma específica la movilización de colesterol en membranas independientemente de las composiciones estudiadas. Este efecto parece estar asociado con una actividad de fragmentación de vesículas inducida por la SP-C, que da lugar a liposomas de pequeño tamaño y gran curvatura a partir de vesículas unilamelares de mayor diámetro. Curiosamente, este efecto no se detectó en presencia de SP-B, sugiriendo la existencia de una modulación por interacción SP-B/SP-C. La fragmentación de vesículas y la interdigitación de lípidos mediadas por la SP-C parecen estar asociadas a fuertes interacciones proteína/lípido, las cuales resisten la solubilización por disolventes orgánicos como demuestran ensayos de cromatografía en capa fina (TLC). Finalmente, se determinó el efecto de la SP-C y el colesterol sobre la incorporación de lípidos en una línea celular de macrófagos alveolares de ratón (MH-S). La combinación de ambos elementos da lugar a una mayor incorporación lipídica por parte de las células mediante diferentes mecanismos. Además, el tratamiento con lípidos altera el estado transcripcional celular, afectando la expresión de genes relacionados con el transporte y metabolismo de lípidos y distintos factores de transcripción. Las células tratadas acumulan los lípidos en forma de lipid droplets, mientras que la SP-C parece localizarse en la membrana plasmática. En conclusión, el trabajo experimental presentado en esta Tesis revela actividades moduladoras de la SP-C sobre la estructura y dinámica de membranas de surfactante. Junto con los efectos del colesterol, estos resultados contribuyen a la comprensión de la relevancia fisiológica de la SP-C en el marco del surfactante y la homeostasis pulmonar.