Caracterización del dominio transmembrana del receptor de neurotrofinas p75 y su papel en la dimerización, localización subcelular, procesamiento y señalización

Résumé

Los factores neurotróficos (neurotrofinas) son proteínas que juegan un papel clave en diversos aspectos de la vida de las neuronas, incluyendo su generación, supervivencia, migración, crecimiento axonal, conectividad sináptica y respuesta a daño. p75NTR es un receptor transmembrana, miembro de la familia de receptores de factores de necrosis tumoral (TNFR), que interacciona con todos los factores neurotróficos y también con sus precursores inmaduros. Además de p75NTR, las neurotrofinas también señalizan a través de los miembros d dela familia de receptores tirosina quinasas, TrkA, B y C. Mientras que los receptores Trk son responsables de la mayor parte se las señales de supervivencia y crecimiento mediadas por neurotrofinas, la señalización de p75NTR puede promover tanto supervivencia como inducir muerte neuronal, reducir el crecimiento axonal o disminuir la función sináptica. Aunque todavía no se conocen exactamente los mecanismos de señalización por los que p75NTR participar en tan diversas funciones, sus diferencias funcionales y estructurales con los demás TNFR sugieren que p75NTR utiliza distintas rutas de señalización. De hecho, se ha descrito la relevancia del puente disulfuro mediado por la Cys257 de p75NTR para transmitir su señalización mediada por neurotrofinas. En este trabajo hemos intentado profundizar en la conformación del dominio transmembrana (TM) de p75NTR y en cómo la dimerización afecta su segregación y procesamiento. Para ello inicialmente resolvimos por RMN la estructura tridimensional de los dímeros TM del receptor salvaje (p75-TM-wt) y del mutante funcionalmente inactivo (p75-TM-C257A). Mientras que la formación del dímero de p75-TM-wt implicaba el establecimiento de un enlace covalente entre los residuos de Cys257, el mutante p75-TM-C257A formaba dímeros a través del motivo AxxxG situado en la cara opuesta de la ¿-hélice y que recuerda al motivo clásico de dimerización GxxxG. A raíz de nuestros datos estructurales, estudiamos el reclutamiento de los dímeros de p75NTR en balsas lipídicas. Estas regiones de la membrana son consideradas como plataformas de señalización que además pueden regular la formación de vesículas, contribuyendo al tráfico de lípidos y proteínas. El aislamiento de balsas lipídicas de cerebros de ratón mostró que los dímeros disulfuro de p75NTR se localizaban dentro de estas balsas y sugerían que su ratio dímero-monómero podía variar entre diferentes poblaciones neuronales. Igualmente, mediante experimentos de transfección, encontramos que el mutante también podía localizarse y dimerizar dentro de estas balsas. Nuestros experimentos con diferentes mutantes del dominio transmembrana del receptor nos permitieron concluir que la dimerización transmembrana del receptor, ya sea covalente o no, afecta a la localización de p75NTR dentro de las balsas y que la unión de colesterol estabiliza los dímeros dentro de éstas. Finalmente, analizamos la implicación de la dimerización covalente transmembrana sobre el procesamiento de p75NTR por RIP. Durante el RIP, p75NTR es primero cortado por una alfa-secretasa que genera un fragmento C-terminal (CTF) y a continuación, el dominio TM es cortado por una segunda enzima, gamma-secretasa, que libera un fragmento intracelular soluble (ICD). El procesamiento tanto del receptor salvaje como de distintos mutantes reveló que los pequeños residuos del motivo AxxxGxxA son importantes para el reconocimiento y/o corte por gamma-secretasa. De forma similar, experimentos realizados in vitro con el receptor salvaje y el mutante p75-C257A mostraron que la formación del puente disulfuro entre las Cys257 inhibe el corte de la enzima gamma-secretasa y que los monómeros del receptor constituyen un mejor substrato para ésta.