Evaluación del papel de los péptidos galanina y adrenomedulina en la enfermedad inflamatoria intestinal

Resumen

Son ya más de tres décadas las que se llevan estudiando los factores relacionados con la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y muchos de ellos han sido parcialmente caracterizados; destacamos los cambios ambientales, la susceptibilidad genética, la flora entérica comensal y la respuesta inmunitaria [1]. Entre ellos, el componente más investigado y mejor comprendido es la respuesta inmune intestinal, incluyendo los cambios relacionados con la respuesta innata y la adaptativa. Precisamente, el conocimiento de la relación inmunidad-inflamación, y su influencia a nivel sistémico y de las mucosas, ha permitido el desarrollo de potentes antiinflamatorios e inmunosupresores. Entre estos mecanismos podemos destacar el papel regulador de los péptidos gastrointestinales, con funciones claves para el control de la homeostasis tisular [2]. En base a estos antecedentes el objetivo general planteado en esta tesis fue avanzar en el conocimiento del papel que los péptidos reguladores, presentes en la pared intestinal, tienen en el origen y evolución de la EII, así como su potencial terapéutico tras su administración sistémica. Los péptidos seleccionados para nuestro estudio han sido galanina y adrenomedulina. Galanina es un péptido neuroendocrino con amplia distribución en el sistema nervioso central y periférico e implicado en numerosas funciones biológicas. Existen evidencias que revelan un papel en la regulación inmunológica y los datos sugieren que este péptido podría ser una interesante alternativa para este tipo de patologías [3]. Sin embargo, los efectos inmunomoduladores del péptido en relación con la EII no han sido probados todavía. Por tanto, uno de los objetivos planteados fue valorar los efectos de la administración de galanina en un modelo experimental de EII inducido por el ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS) en rata, analizando los resultados observados tanto durante la fase aguda de la enfermedad como en el proceso crónico de la misma. Los resultados mostraban cómo galanina ejercía un efecto beneficioso ya que con todas las dosis ensayadas se observaba una reducción de la extensión y severidad del daño en el colon, acompañado de una menor incidencia de diarrea, adherencias y pérdida de peso corporal así como de una disminución del infiltrado neutrofílico en el tejido, de la citocina pro-inflamatoria factor de necrosis tumoral alpha (TNF-¿) y de la expresión y actividad de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) [4,5]. Otro péptido que está generando expectativas muy prometedoras es la adrenomedulina. Esta molécula está presente en una gran variedad de tejidos y fluidos corporales, actuando como mediador autocrino, paracrino o endocrino en una gran variedad de funciones fisiológicas [6]. Existen interesantes evidencias que sugieren que adrenomedulina podría actuar como un factor inmunomodulador endógeno, con efectos fundamentalmente antiinflamatorios [7]. Con este punto de partida nuestra investigación se centró en un principio en evaluar, de manera similar a galanina, la actividad farmacológica de este péptido según el modelo agudo y crónico de daño inflamatorio en colon inducido por el hapteno TNBS, y conocer los mecanismos farmacológicos de respuesta, que incluyen la producción de citocinas y la expresión/actividad de las enzimas ciclooxigenasa-2 (COX-2) e iNOS. Los resultados mostraban que la administración de adrenomedulina ejercía efectos protectores durante las fases aguda y crónica de la colitis experimental; el estudio macroscópico del colon reveló que el péptido disminuía la extensión de la inflamación, si bien los efectos beneficiosos eran más evidentes en las fases más tardías de la enfermedad. Los estudios dosis-respuesta confirmaron la gran potencia del péptido, ya que las dosis más bajas ensayadas (50-100 ng/Kg) tenían evidentes propiedades curativas, sin signos asociados de toxicidad; por el contrario, dosis más altas (200 ng/kg) provocaban un incremento significativo en la mortalidad de los animales [8]. Continuando las investigaciones con adrenomedulina, nos parecieron muy sugerentes las posibilidades derivadas del empleo de animales con supresión del gen de adrenomedulina. Hasta ahora, las investigaciones animales encaminadas a la eliminación de este gen se han encontrado con el problema de que su carencia total produce la muerte del embrión durante la gestación [11]. El laboratorio del Dr. Alfredo Martínez ha desarrollado un modelo de ratón knockout (KO) inducible para el gen de la adrenomedulina, utilizando la tecnología Cre/LoxP [12] que posibilita la inducción de la pérdida del gen en ratones adultos tras tratamiento con un inductor administrado ectópicamente. De esta manera los ratones presentan un desarrollo embrionario normal. Nuestros objetivos se centraron ahora en profundizar en las consecuencias de la supresión total del gen de adrenomedulina en el modelo de colitis experimental aguda por TNBS, utilizando ratones KO inducibles para el péptido. Nuestros resultados mostraron que los ratones deficientes en el gen de la adrenomedulina son más sensibles al daño producido por TNBS que los animales no modificados genéticamente. Así, la supresión indujo una diarrea más intensa, acompañada de una mayor pérdida de peso corporal, y un aumento significativo de la relación peso/longitud del colon así como un incremento en los niveles de citocinas derivadas de Th1 (TNF-¿, interferon gamma (IFN-¿), interleucina 6 (IL-6)) y de la expresión de la proteína COX-2. Investigaciones previas han mostrado que adrenomedulina está muy implicada en carcinogénesis y progresión de tumores, mostrándose su expresión muy incrementada en numerosas líneas tumorales y tejidos malignos, incluyendo el cáncer colorectal [13]. Estos datos sugieren que este péptido podría ser una importante diana biológica para el desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer. Por otra parte, el cáncer colorectal se considera una de las complicaciones más severas de la EII. Por tanto, nuestro siguiente objetivo fue investigar sobre los cambios progresivos que se producen en la mucosa intestinal sometida a inflamación crónica y que termina evolucionando a displasia y cáncer colorectal. Para llevar a cabo este estudio, seguimos un modelo animal de inflamación crónica en intestino grueso provocado por la ingestión en el agua de bebida de dextrano sulfato sódico (DSS), según ciclos pre-establecidos y valoramos marcadores de inflamación y cáncer. Además, y dado el papel relevante que adrenomedulina tiene en la carcinogénesis, y los pocos datos de que disponemos sobre su relación con el cáncer colorectal, nos planteamos conocer los cambios de expresión y localización de adrenomedulina en colon según este modelo secuenciado de inflamación crónica y cáncer. Los resultados de este estudio corroboraban que la enfermedad inflamatoria estaba presente desde los primeros ciclos y su gravedad se incrementaba gradualmente a medida que los ciclos de DSS avanzaban, con un máximo de actividad en el 10º ciclo (170 días desde el inicio del tratamiento con DSS), como los resultados de producción de citocinas y de expresión de las proteínas COX-2, iNOS y prostaglandina sintasa-1 mostraban. Los tumores macroscópicos solamente fueron detectados después de 15 ciclos de DSS (255 días), si bien el estudio microscópico mostraba una correlación entre inflamación y displasia a medida que los ciclos con DSS progresaban. Por otra parte, se ha sugerido que la translocación de ß-catenina desde la membrana celular al citoplasma y al núcleo es un marcador importante para el cáncer colorectal. En el presente estudio, la expresión de esta proteína estaba limitada a la membrana celular en los animales sanos, mientras que en los grupos tratados con DSS la localización citoplasmática y nuclear se fue incrementando según los ciclos, con cambios máximos después de 15 ciclos de DSS. En la misma línea, el estudio de la localización del antígeno nuclear de proliferación celular mostraba la presencia de células en proliferación en todos los ciclos ensayados, aunque su expresión nuclear fue más intensa en los animales tratados con DSS durante 15 ciclos. En relación a la expresión de adrenomedulina, nuestras investigaciones observaron cambios interesantes de intensidad y localización, según los ciclos. Así, en los animales tratados con 5 y 10 ciclos de DSS, se observó una moderada expresión del péptido en el lado apical del citoplasma de las células epiteliales y en la superficie luminal, aunque algunas zonas mostraron localización nuclear después de 10 ciclos de DSS. En los animales expuestos a 15 ciclos de DSS adrenomedulina se localizó en los núcleos de las células en amplias zonas de la glándula, y coincidente con zonas de transformación displásica. Estos datos demuestran el papel de este péptido en el desarrollo del cáncer colorectal asociado a colitis ulcerosa. Aun más, la expresión nuclear de adrenomedulina observada en las células displásicas sometidas a la inflamación crónica podría servir como marcador tumoral para la detección de este tipo de cáncer. Una alternativa interesante que podría utilizarse para inhibir la expresión génica de adrenomedulina es la utilización de la tecnología del ARN de interferencia. Esta técnica presenta numerosas ventajas y parece tener una importante aplicación en el tratamiento del cáncer al conseguir la supresión de la expresión de oncogenes, genes antiapoptóticos o genes que intervienen en la progresión de tumores [14]. Nuestras investigaciones avanzaron según estas premisas. Dado que existen muy pocos estudios que valoren la implicación de adrenomedulina en la patogénesis del cáncer colorectal, nuestro último objetivo fue investigar el papel de esta molécula en la supervivencia de células cancerosas de colon, utilizando para ello ARN de interferencia y así inhibir la expresión génica de adrenomedulina. En primer lugar, se detectó la presencia de este péptido en varias líneas celulares ensayadas, incluyendo cuatro líneas celulares de cáncer de colon. Es interesante constatar que a partir de los datos obtenidos observamos que las líneas celulares que presentaron los mayores niveles de expresión de adrenomedulina fueron las células de adenocarcinoma de colon HT29 y HCT116. Con el fin de elucidar el papel de la adrenomedulina endógena en la función de las células de cáncer de colon, esas dos líneas celulares fueron transfectadas con ARN de interferencia frente a adrenomedulina, consiguiéndose una disminución en su expresión de más del 50% en ambas líneas y tras 24 horas de la transfección. Más aún, en las células HT29 esta inhibición alcanzó el 80% después de 6 días de la transfección, mientras que en las células HCT116 se mantuvo la reducción de la expresión génica en un 50% aproximadamente durante todo el experimento. Los efectos de la supresión parcial del gen de adrenomedulina fueron evaluados sobre la proliferación celular. Para ello, las células HCT116 y HT29 se cultivaron en un medio suplementado con suero al 1%, o bien en un medio libre de suero, valorándose la supervivencia mediante el ensayo de metiltiazol-tetrazolio, después de 3 y 6 días de la transfección con ARN de interferencia frente a adrenomedulina. La disminución de la expresión de esta molécula consiguió reducir la proliferación celular en todas las condiciones ensayadas y en ambas líneas celulares. Sin embargo, este efecto fue más marcado en condiciones libres de suero y pasados 6 días de la transfección, observándose en este tiempo una inhibición del crecimiento celular del 38% y 30% en las células HT29 y HCT116, respectivamente. Los resultados de este trabajo demuestran la presencia de adrenomedulina en varias líneas celulares cancerosas, así como que la adrenomedulina endógena desempeña una importante función en la supervivencia de las líneas celulares de cáncer colorectal. Estos hallazgos apoyan el papel del péptido como factor de supervivencia en tumores de colon y apuntan a que esta molécula podría ser una posible diana terapéutica para el tratamiento del cáncer. No obstante, se requieren futuras investigaciones para conocer su participación en los mecanismos patogénicos del cáncer colorectal. En resumen, la mucosa intestinal es un tejido con un control inmunológico muy estrecho y, en condiciones normales, los procesos inflamatorios que se producen son eficazmente controlados por el sistema inmune. Los mecanismos responsables son amplios y complejos e incluyen a las células epiteliales, diferentes poblaciones linfocitarias y células inmunocompetentes, entre otras. Los mensajes de control inter- e intracelular están protagonizados por diferentes mediadores, siendo los péptidos reguladores claves en estas funciones, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. En este estudio, demostramos la actividad de dos de ellos, galanina y adrenomedulina, con una gran potencialidad en patologías de índole inflamatoria, incluyendo aquellas que el término EII engloba, y también el cáncer colorectal.