Mecanismos de acción tóxica producidos por la toxina T-2 y sus metabolitos en modelos de células hepáticas humanas 2D y 3D y mecanismos de defensa antioxidantes

Abstract

En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la evaluación de los efectos tóxicos producidos por la toxina T-2 y sus metabolitos HT-2, neosolaniol (Neo), T2-triol y T2-tetraol mediante métodos alternativos a la experimentación animal, concretamente modelos de predicción in silico y modelos in vitro en células de hepatocarcinoma humano (HepG2). Debido a que la T-2 es la micotoxina más citotóxica de los tricotecenos, los resultados obtenidos pueden contribuir a un mayor conocimiento de sus mecanismos de acción toxicológica. De esta manera se puede realizar una evaluación del riesgo más precisa, y adoptar medidas adecuadas para prevenir o mitigar el daño producido tras su exposición. Para ello, se evalúan las propiedades toxicológicas y de los procesos ADME de la T-2, HT-2, Neo, T2-triol y T2-tetraol utilizando los métodos de predicción in silico AdmetSAR y SwissAdme. Tras observarse potenciales efectos tóxicos, se procede a la evaluación de la toxicidad de la T-2 y sus metabolitos HT-2, Neo, T2-triol y T2-tetraol en un modelo in vitro, con células HepG2 de forma individual y combinada, mostrando valores de IC50 entre 59,6 y 2770 nM. A continuación, se identifica y cuantifica la T-2 y sus principales productos de biotransformación en el medio extra e intracelular tras 24 h de exposición de la T-2 a las células HepG2, observándose la completa metabolización de T-2 y la fluctuación de los niveles de sus metabolitos tanto en la fracción celular como en el medio de cultivo, siendo HT-2 el mayoritario. Debido a la coexistencia de la T-2 y sus metabolitos, se determina el tipo de interacción entre ellos, y se evidencian diferentes efectos dependiendo de la combinación de micotoxinas y las concentraciones en la mezcla. Así, se observa efectos antagónicos en las combinaciones de T-2 + T2-triol, T-2 + Neo, Neo + T2-triol, Neo + T2-tretraol y Neo + HT-2, y efectos antagónicos a concentraciones bajas y aditivos a altas en las combinaciones de T-2 + HT-2, T-2 + T2-tetraol, T2-triol + HT-2, T2-triol + T2-tretraol y T2-tetraol + HT-2. Como posible mecanismo de acción tóxica, a continuación se evalúa la capacidad de la T-2 y sus metabolitos de generar especies reactivas de oxígeno (ROS) y el papel protector de los sistemas de defensa celular y enzimático. Respecto a la defensa celular, se observa una disminución general del glutatión (GSH) tras la exposición a las micotoxinas. Sin embargo, se observa una gran variedad de resultados, dependiendo de la micotoxina y de la concentración evaluada, en cuanto a la defensa enzimática (glutatión peroxidasa, GPx; glutatión transferasa, GST), catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD) en las células HepG2. El papel del GSH y las enzimas relacionadas (GPx y GST) en la defensa de las células HepG2 expuestas a la T-2 y sus metabolitos se confirma con el incremento de su actividad a nivel celular tras la adición de N-acetil-cisteína (NAC) y la reducción tras la adición de D-L-butionina-(S, R)-sulfoximina (BSO). Por otra parte, también se evalúa el efecto citoprotector de sustancias bioactivas presentes en legumbres (judías rojas), microalgas (Tetraselmis chuii y Phaeodactylum tricornutum) e hidrolizados de pescado, todos ellos componentes de la dieta Mediterránea y debido a su alto contenido en antioxidantes. Por otra parte, la exposición de las células HepG2 a la T-2 pone de manifiesto una alteración de la proliferación celular observada con la disrupción del ciclo celular, que podría estar relacionado con los procesos de muerte celular apoptosis y necrosis. Además, se observa daño al ADN tras la exposición a T-2, el cual se determinó a través de ensayos de genotoxicidad, concretamente el ensayo de micronúcleos y el ensayo del cometa. No obstante, la exposición a T-2 no causó efecto mutagénico mediante el ensayo de la mutación genética reversa bacteriana. Finalmente, se aplica un modelo celular tridimensional (3D) de esferoides de células hepáticas en dispositivos microfluídicos para simular el entorno biológico in vivo y obtener resultados más precisos y relevantes para el estudio de la citotoxicidad de la T-2 en modelos hepáticos. Se estudian y comparan dos modelos de cultivo celular 3D en dispositivos microfluídicos: esferoides de monocultivo con células HepG2 y esferoides de co-cultivo con células HepG2 y LX2. Con estos modelos, se evalúan los efectos citotóxicos de la T-2 mediante diferentes procesos, tales como viabilidad celular, albúmina, enzimas metabólicas hepáticas y citoquinas inflamatorias. Los resultados obtenidos con los esferoides de co-cultivo en dispositivos microfluídicos confirman que los efectos observados tras la exposición de la T-2 presentan un enfoque más realista de las condiciones hepáticas que los obtenidos con esferoides de monocultivo o en placas estándar. En resumen, los resultados obtenidos indican que la T-2 y sus metabolitos podrían suponer un riesgo para la salud humana. Por lo que sería necesario ampliar los conocimientos de los mecanismos de toxicidad para poder prevenir efectos adversos de la T-2 y sus metabolitos y reducir la exposición a través de la dieta para proteger la salud del consumidor.